Bài giảng Công nghệ sinh học - Chương II: Công nghệ gene (genetics engeneering)

pBước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm1. Enzyme1.1. 	Restriction endonuclease enzyme (RE)1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩnHệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .1. Enzyme1.1. 	Restriction endonuclease enzyme (RE)Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau.Quy tắc đặt tên: EcoRI	Eco: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn 	 I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên)1. Enzyme1.2. Enzyme nối (Ligase)- Nối : hình thành cầu phosphodiesterAATTCGGCTTAALigaseGCTTAAAATTCGEcoRIEcoRIGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGLigation. (ligere = latin ‘to join’)1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD+ dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme.2. Activated enzyme donates AMP to free 5’-PO4= at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick.3. Cleavage of the di-phosphate bond liberates energy to create a new phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA.N.B. Reaction can occur on Both Strands, allowing joining of two independent DNA molecules.1. Enzyme1.3. Enzyme phiên mã ngược 	(reverse transcriptase)Tổng hợp DNA một mạch c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợpc-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA1.4. Các enzyme khác Enzyme Chức năngDNaseIEndonuclease Nuclase BAL31Exon nucleaseS1 nucleaseCắt DNA mạch đơnĐoạn KlenowDNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’Taq polymeraseDNA polymerase chịu nhiệt1. Enzyme2. Các vector chuyển genePlasmid: DNA vòng trònSao chép độc lập trong tế bàoCó khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành proteinVector: Có khả năng tự tái bảnTồn tại độc lập trong tế bàoMang được gene mong muốnYêu cầu đối với vector chuyển gene.Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)Trình tự nhận biết cho RETrình tự điều hòa (promoter)Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợpCó gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết.2. Các vector chuyển geneỨng dụng của vector chuyển geneTạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình tự DNAChuyển geneSản xuất RNASản xuất protein từ gene được tạo dòng.2.1. Vector chuyển gene plasmidPlasmid của vi khuẩn và bacteriophage.pBR3222. Các vector chuyển gene2.2. Phage λCó hệ thống xâm nhập tự động và sinh sảnCó dạng tròn hoặc dạng thẳng, 2 đoạn cos (12 nu) ở 2 đầu mút, dùng tạo cosmid và phagemidMang được đoạn DNA (15-23Kb)Dùng trong thành lập ngân hàng gene2. Các vector chuyển gene2.3. Cosmid : Plasmid gắn thêm đoạn cos của phage, Có thể chứa đoạn gene dài đến 45kbDùng lập thư viện gen2. Các vector chuyển gene2.4. Phagemid2.5. Phage M13: DNA mạch đơnDùng xác định trình tự nucleotide của geneSản xuất mẫu dò (probe)Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis)2. Các vector chuyển gene2.5. Plasmid TiAgrobacterium tumefaciensChuyển gen ở thực vật200KbChuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào2. Các vector chuyển gene2.6. Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC-yeast artificial chromosome)- Plasmid vòng tròn 2mChứa đoạn DNA lạ dài đến 2000Kb2. Các vector chuyển gene2.7. Các nhiễm sắc thể nhân tạo khácBAC (Bacterial artificial chromosome)MAC (Mammalian artificial chromosome)P1AC (P1 bacteriophage derived artificial chromosome)3. Hệ thống tế bào chủ (Host)Mục đích:Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.Biểu hiện geneSản xuất protein tái tổ hợp.3.1. Escherichia coli (E.coli)Dễ nuôi cấy và nhân dòngDễ chấp nhận các loại vector khác nhau.Vi khuẩn Gram-, hình que, Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base3. Hệ thống tế bào chủ (Host)3.2. Saccharomyces cerevisiaeĐối tượng nghiên cứu của vi sinh vật EukaryotePhân lập được nhiều promotor hoạt động mạnhThực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học.Sản xuất protein tái tổ hợpSinh vật an toàn3.3. Hệ thống tế bào thực vật3.4. Hệ thống tế bào động vậtTế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidneyTế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein ngườiTế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans3. Hệ thống tế bào chủ (Host)Lai nucleic acidTách chiết và tinh sạch DNA và RNAĐiện di trên gel+-WellsSmallLargeKỹ thuật và phương pháp căn bảnLai nucleic acid Lai trên pha rắn	Southern blot, Northern blot, 	Western blot, Dot và slot blotKỹ thuật và phương pháp căn bảnLai nucleic acid Lai trên pha rắn	Kỹ thuật và phương pháp căn bảnDot và slot blot dùng cho RNA và DNALai nucleic acid Lai trên pha rắnLai tại chổ 	(in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid tại chổ không cần phải tách chiết ra ngoài	Kỹ thuật và phương pháp căn bản2. Thu nhận geneThu nhận DNA từ bộ gene	* Shotgun	* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa họcLập ngân hàng c-DNA	* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)	* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobineKỹ thuật và phương pháp căn bản2. Thu nhận geneThu nhận DNA từ bộ geneTổng hợp gene bằng phương pháp hóa họcLập ngân hàng c-DNA	* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)	* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobineKỹ thuật và phương pháp căn bản3. Tạo plasmid tái tổ hợpDùng đầu so leKỹ thuật và phương pháp căn bản3. Tạo plasmid tái tổ hợpDùng đầu so leDùng các đoạn nối (linkers)Kỹ thuật và phương pháp căn bản3. Tạo plasmid tái tổ hợpDùng đầu so leDùng các đoạn nối (linkers)Dùng enzyme terminal transferaseKỹ thuật và phương pháp căn bản4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoHóa biến nạpTế bào vi khuẩn không có plasmid có khả năng dung nạp (competent cell)Ủ hỗn hợp, xử lý CaCl2 lạnh + sốc nhiệt (42oC, 2 phút)Kỹ thuật và phương pháp căn bản4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoa) Hóa biến nạpb) Điện biến nạp (electroporation)Kỹ thuật và phương pháp căn bản4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoa) Hóa biến nạpb) Điện biến nạp (electroporation)c) Vi tiêm (micro-injection)d) Bắn gene....Kỹ thuật và phương pháp căn bảnDNA coated golden particlesGene gunCell divisionA plant cell withthe new geneTransgenic plantPlant cellCell’s DNA5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện genea) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợpKỹ thuật và phương pháp căn bản5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện genea) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợpKỹ thuật và phương pháp căn bảnb) Tạo dòngc) Sự biểu hiện của gene được tạo dòngVector biểu hiệnYêu cầu:Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bàoPromotor biểu hiệnTrình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốtSự ổn định lâu dàiTránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bàoPCR (Polymerase Chain Reaction)1985, Kary Mullis1. Nguyên tắc2. Các thành phần của phản ứngPrimer Polymerase chịu nhiệtdNTPDung dịch đệmPCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau. 	1. 1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94oC2. Bắt cặp: lai giữa primers và dây đơn DNA. Nhiệt độ thay đổi tùy theo, khoảng 50oC3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và dNTPs: 72oC.Lập lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện diPCR (Polymerase Chain Reaction)3. Ý nghĩaThời gianHiệu quả kinh tếThực hiện4. Cách dạng PCR khácRT-PCR Competitive RP-PCRReal Time PCRPCR- ELISASequencing Phương pháp hóa học của Maxam và GilbertSequencing Phương pháp hóa học của Maxam và GilbertPhương pháp didesoxy của F. SangerỨng dụng công nghệ geneKhai thác DNA các bộ gene1.1. Genomics: Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúngPhát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.1.2. ProteomicsNghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function)Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.1.3. Human Genome Projet1.4. Các ngành học khácCellomicsMetabolomicsIonomics Ứng dụng công nghệ geneKhai thác DNA các bộ geneCông nghệ RNArRNA, mRNA, tRNAribozymeRNAi, microRNAMạng lưới RNAThụ động Slipcing Postranscriptional regulation Công nghệ RNA Antisense RNAInterfering RNA và microRNACác ribozymeỨng dụng công nghệ geneKhai thác DNA các bộ geneCông nghệ RNACông nghệ protein tái tổ hợp- Sản xuất r-protein STTSản phẩmCác bệnh điều trịNăm hết patent1InsulinTiểu đường20012Interferon alphaViêm gan siêu vi B, ung thư, ..20023Interferon betaXơ cứng20034Hormon tăng tưởng ngườiThiểu năng tăng trưởng20035ErythropoetinThiếu máu20046T-PA (tissu plasminogen activator)Nhồi máu cơ tim20057G-CSF (granulocyte – COLONY Stimulating FactorChemotherapy-induced neutropenia2006Ứng dụng công nghệ geneKhai thác DNA các bộ geneCông nghệ RNACông nghệ protein tái tổ hợpSản xuất r-proteinChế tạo protein	* Nối các đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein)	* Làm mất đoạn hoặc tăng đoạn gene	* Thay thế nucleotide Ứng dụng công nghệ geneKhai thác DNA các bộ geneCông nghệ RNACông nghệ protein tái tổ hợpChẩn đoán phân tửDựa trên phương pháp lai DNADNA markerBiomarkerDNA fingerprintingMicro array và Biochips5. Vi sinh vật chuyển gene6. Thực vật chuyển gene7. Động vật chuyển gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử5. Vi sinh vật chuyển gene6. Thực vật chuyển gen7. Động vật chuyển gene8. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người	Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)	* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân	* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị	Pharmacogenomics: 	Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân	Gene therapy: 	* Dùng rprotein hoặc bổ sung enzyme	* Thay thế geneỨng dụng công nghệ geneHết chương IICòn 4 chương lý thuyết và 8 seminarsHẹn tuần sau !