Bài giảng Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào - Khúc Thị An

ường khác . 
Môi trường F10, F12: do R.Ham thiết lập dùng cho các nguyên bào sợi . 
Môi trường Iscove : do Iscove thiết lập trên cơ sở cải biến môi trường DMEM 
Môi trường 5A do Mc.Coy thiết lập 
Môi trường RPMI – 1640: do Moore thiết lập dùng để nuôi cấy tế bào và mô bạch huyết 
Môi trường 199 do Parker thiết lập dùng để nuôi cấy tế bào mô cơ phôi gà trong sản xuất vacxin phòng bại liệt 
Môi trường không có huyết thanh 
Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật , tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều ( chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy ). 
Huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, nấm và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau . 
Huyết thanh còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào  Vì lý do đó mà nhiều nghiên cứu đã xây dựng môi trường không có huyết thanh hay dùng với liều lượng thấp . 
Môi trường không có huyết thanh 
Có hai phương pháp điều chế môi trường không có huyết thanh là phương pháp của Sato và phương pháp của Ham. 
Cả hai phương pháp này đều thay huyết thanh bằng những yếu tố khác nhau : kích thích tố (hormone), nhân tố tăng trưởng , protein vận chuyển , nhân tố kết dính , các chất dinh dưỡng , khoáng 
Dung dịch muối cân bằng (dung dịch đệm ) 
Là một hỗn hợp muối vô cơ , trong đó thường có bicacbonate natri và glucose 
Được sử dụng như một dung dịch pha loãng những môi trường fức tạp , môi trường dùng để rửa mẫu , để tách các tế bào từ mô hoặc trải các tế bào thành từng lớp đơn , huyền phù tế bào 
Một số dung dịch muối cân bằng thường dùng : PBS (Phosphate Buffered Saline), HEPES, MEM, EBSS, HBSS 
Các phương pháp nuôi tế bào động vât 
Trong nuôi cấy tế bào động vật , tuỳ từng mục đích ngiên cứu mà người ta có thể chọn lựa một hay nhiều phương pháp khác nhau : 
a.Phương pháp nuôi cấy cơ quan : 
	 Toàn bộ phôi hoặc cơ quan được cắt từ cơ thể bằng cách giải phẫu cơ thể còn sống hoặc thậm chí từ tử thi ( hoặc động vật ) vưa mới chết lâm sàn ( chết não ) hoặc có thể tách mầm các bộ phận của phôi đang phát triển . 
Các phương pháp nuôi tế bào động vât 
b.Phương pháp nuôi cấy mô : 
	 Thông thường , người ta cắt một vài mảnh mô hoặc tổ chức cơ quan và tiến hành nuôi trong các điều kiện thích hợp . Sau thời gian nuôi cấy , xung quanh miếng mô nuôi cấy sẽ xuất hiện một vùng sinh trưởng mới bao gồm các tế bào đang phân chia . Có thể tách các tế bào mới này , định dạng , phân loại chúng để quan sát hoặc nuôi cấy chuyền theo yêu cầu . 
Các phương pháp nuôi tế bào động vât 
C. Nuôi cấy tế bào : Mô hoặc khôi u phải được phân tách bằng enzym hoặc bằng máy vi phẫu tế bào thành các dòng tế bào đơn hoặc dạng huyền phù rồi mới tiến hành nuôi cấy . 
3.1.Mô hình thực nghiệm 
Khảo sát tác động của hoá chất 
Một hoá chất trị bệnh , trước khi được phép lưu hành , phải trải qua nhiều thử nghiệm , trong đó có giai đoạn thử nghiệm trên động vật và tất nhiên kết quả không phải lúc nào cũng mở rộng cho người . Thí ngiệm lâu dài và tốn kém . 
Vì vậy khuynh hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm ngày càng tăng , nhất là khi người ta có khả năng nuôi cấy hầu như bất kỳ loại tế bào nào . 
Mô hình thực nghiệm 
Thử độc tính của hoá chất trên tế bào nuôi cấy . Vấn đề được đặc biệtquan tâm là độc tính đối với vật chất di truyền do các chất chuyển hoá trong tế bào gắn lên DNA. Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên té bào bằng các chất độc , từ đó phát hiện ra bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hoá và phân tử của quá trình chuyển hoá chất độc . 
Trong công nghiệp mỹ phẩm : Ứng dụng tế bào nuôi cấy để thử nghiệm tính gây kích thích của các mỹ phẩm 
3.2. Sản xuất các chế phẩm sinh học 
Văcxin virus. Các văcxin virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã đóng góp vô giá vào sự cải thiện Y tế cộng đồng trên toàn thế giới , điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa ho gà , lao , sởi , bạch hầu , uốn ván , và chứng bại liệt ở trẻ em . Vacxi viêm gan B 
Trong lĩnh vực thú y: vacxin lở mồm long móng cho súc vât nuôi , vacxin phòng dại ,  
Sản xuất văcxin 
Để sản xuất văcxin , người ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào để đạt mật độ tối đa . Sau đó virus được trích ly và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt như formaldehyde trước khi được sử dụng làm vacxin . 
Ví dụ 
Văcxin phòng chống HBV(virus viêm gan siêu vi B) được sản xuất bằng dòng tế bào ung thư gan ở người . 
Văcxin phòng bệnh sởi được sản xuất từ nuôi cấy tế bào phôi gà và gây nhiễm vi rút . 
Văcxin phòng bại liệt được sản xuất từ việc nuôi cấy tế bào thận thai khỉ . 
Sản xuất Insulin bằng công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp 
Là protein chứa 51 amino aid được tổng hợp ở tuyến tuỵ của người . 
Để chữa trị bệnh tiểu đường . 
Thời kỳ đầu người bệnh được điều trị bằng insulin tách từ tuyến tuỵ của bò và heo , nhưng vì cấu tạo của chúng hơi khác với insulin của người nên trong máu của bệnh nhân điều trị bằng insulin bò bao giờ cũng xuất hiện kháng thể . Điều này gây ra một số hậu quả không mong muốn làm mất một phần hoạt tính của insulin và giảm thời gian tác động của thuốc . 
Quy trình sản xuất 
Phân tử Insulin gồm 2 chuỗi polipeptit : chuỗi A 21 gốc và chuỗi B 30 gốc . Hai chuối này gắn với nhau qua các cầu nối disunfua . 
S 
S 
S 
S 
Sợi A của insulin 
Sợi B của insulin 
Quy trình sản xuất 
Tổng hợp gene mã hoá sợi A insulin, đưa gen này vào plasmid. Sau đó chuyển Plasmid vào E.Coli . 
Làm tương tự với gen mã hoá sợi B insulin. 
Nuôi cấy vi khuẩn Ecoli . Cùng với sự phát triển của vi khuẩn thì sợi A và B của insulin cũng được tổng hợp . 
Làm tan tế bào và tách các sợi insulin ra . 
Oxy hoá hai sợi A, B thu được phân tử isulin . 
Sản xuất interferon bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 
Interferon là nhóm protein chứa khoảng 146 – 166 amino acid, chúng xuất hiện trong tế bào động vật có xương sống khi bị nhiễm virus và giúp tế bào kháng lại virus. 
Ngoài ra Interferon còn có 2 đặc tính rất giá trị : 1) Chúng ức chế sự sinh sản của tế bào ( nên được sử dụng để chữa trị bênh ung thư ); 2) Chúng gia tăng hoạt độ hệ miễn dịch của người và động vật . 
Có 3 loại Interferon : α - Interferon, β - Interferon, γ - Interferon 
Sản xuất interferon bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 
Trước đây , interferonchủ yếu được tạo rừ tế bào bạch cầu hay nguyên bào bạch huyết của người khi bị nhiễm virus, do vậy rất đắt tiền và hiếm . 
Cho đến nay, người ta đã tạo được các gen mã hoá tổng hợp 3 loại interferon và dã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất interferon trong tế bào E.coli và nấm men. Nhờ vậy đã làm giảm giá thánh của interferon rất nhiều . 
4.Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng . 
Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật , có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó . 
Kháng nguyên ( chất sinh miễn dich ) là chất khi đưa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch . 
Kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào sinh ra để chống lại một kháng nguyên nhất định . 
Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 
Năm 1975 Milstein và Kohler đã đưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng được tạo ra bằng cách kết hợp hai loại tế bào : tế bào u tuỷ ( myeloma ) với tế bào lympho của hệ miễn dịch của người hoặc động vật ( có khả năng tạo một loại kháng thể đặc hiệu ). Tế bào lai sinh ra mang đặc tính của cả hai laọi trên , vừa có khả năng phân chia liên tục trong môi trường nuôi cấy vừa có khả năng sản sinh một loại kháng thể đặc hiệu . 
Nội dung của công nghệ này gồm các bước sau : 
6. Tế bào động vật được sử dụng trong cấy ghép . 
Trước đây , để khắc phục các hiện tượng sai hỏng của cơ thể , người ta sử dụng các tác nhân như thuốc , mô hay cơ quan , bộ phận giả để thay thế . 
Ngày nay, cùng với sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy tế bào , khuynh hướng ghép tế bào trở nên phổ biến . 
Đã có nhiều công trình ghép tế bào : 
- Ghép các tế bào tuỵ tạng sản sinh insulin của heo vào người bệnh tiểu đường dể chữa trị bệnh tiểu đường . 
Các công trình ghép tế bào nuôi cấy 
Ghép tế bào thần kinh láy từ thể vân củ thai cho pháp phục hồi các chức năng của não 
Người ta còn hy vọng khắc phục tình trạng không hoạt động của tuỷ xương bằng cách ghép cho bệnh nhân các tế bào nguồn tạo máu . Các tế bào này trước đó được thu nhận từ chính người bệnh , cho sinh sản và biệt hoá trong môi trường nhân tạo có chứa nhân tố tăng trưởng và được tiêm trở lại với số lượng lớn . 
Các công trình ghép tế bào nuôi cấy 
Ghép tế bào sụn : Trước đây để chữa các thương tổn sụn ở đầu gối , người ta phải sử dụng các bộ phận giả . Tuy nhiên , vật liệu sinh học đê chế tấocc bộ phận này rất kém bền nên cứ sau một thời gian lại phải thay . Mặt khác do êế bào sụn không có khả năng sinh sản để bù đắp thương tổn nên không thể dựa vào sự tái sinh tự nhiên . 
Người ta đã thu nhận sinh thiết từ một phần sụn lành của người bênh , tách rời từng tế bào bằng enzym thuỷ phân . Các tế bào này được nuôi cấy và tiêm trở lại vào nơi bị tổn thương . Ở đó , chúng sinh sản và tái tạo lớp sụn lành thay cho phần hư hỏng 
7 . Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy . 
Để điều trị chứng sơ vữa động mạch , người ta cần thay thế các mạch máu bị hỏng . Các mạch máu nhân tạo kém bền với việc khâu nối và rất dễ bị nghẽn . 
Gần đây , một nhóm nghiên cứu đã sản xuất thành công mạch máu tự nhiên bằng cách nuôi cấy các tế bào động mạch chủ của bò , gồm các tế bào cơ và tế bào nội mô trên một giá thể polymer tự tiêu . 
Thí nghiệm tương tự cới các tế bào lấy từ heo cho pháp sản xuất mạch máu mà khi đem ghép trên heo cho kết quả rất tốt . 
Công nghệ tế bào gốc 
Thế nào là tiềm năng của một tế bào ? 
	- Sau khi trứng và tinh trùng kết hợp với nhau sẽ hình thành nên hợp tử . Để phát triển thành cơ thể , hợp tử phải phân chia để hình thành nên nhiều tế bào . 
	- Đã từ lâu người ta đã chứng minh được rằng hợp tử và các phôi bào ( các té bào ở giai đoạn sớm ) là toàn năng . 
	- Thật vậy , nếu tách riêng mỗi té bào đó có thể cho một cơ thể toàn vẹn với khoảng 200 loại tế bào chuyên hoá .