Bài giảng Nhập môn công nghệ sinh học - Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật

o kiểu như 
Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy 
Tách thành tế bào đơn ( bằng enzyme hay cơ học ) 
Thuận lợi : 
Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. 
Bất lợi : 
Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast 
Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức 
Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn 
11 
Nuôi cấy thứ cấp 
Coy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp 
Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy 
Thường chứa kiểu êế bào đơn 
Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ 
Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy : 
Dòng tế bào 
Dòng tế bào liên tục 
Các kiểu nuôi cấy tế bào 
12 
Dòng tế bào 
Có đời sống hạn định , lão hóa sau một số âần cấy chuyền nhất định ( chừng 30 lần phần chia ) 
Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa 
Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài 
Các kiểu nuôi cấy tế bào 
13 
Experimental Methods 2006 
Dòng tế bào liên tục 
Có thể tăng sinh không hạn định 
Chúng thường là những tế bào chuyển dạng : 
Tế bào từ khối u. 
Nhiễm với các viral oncogenes 
Xử lí hóa chất (chemical treatments). 
Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo. 
14 
Experimental Methods 2006 
Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm ( Transfection ) 
Chuyển dạng 
Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen 
Tốc độ phát triển 
Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) 
Hình thành sản phẩm chuyên biệt 
Kéo dài tuổi thọ 
Mất khả năng bám dính 
Chuyển nhiễm 
Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA) 
15 
Experimental Methods 2006 
Khởi sự một nuôi cấy 
Mô 
Nuôi cấy tế bào sơ cấp 
Dòng tế bào 
Dòng tế bào liên tục 
Phân tách 
Cấy chuyền 
Hạn định số lượng 
Không hạn định số lượng 
Bảo quản 
Bảo quản 
16 
Experimental Methods 2006 
Hình dạng tế bào khi nuôi 
Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính : 
Phát triển huyền phù ( như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào ) 
Dòng tế bào thu từ máu ( leukaemia , lymphoma) 
Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi . 
Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts 
Hela -Epithelial 
MRC5-Fibroblast 
SHSY5Y-Neuronal 
BAE1-Endothelial 
17 
Experimental Methods 2006 
Special types of Cell culture 
 	Cells in the culture can be grown to adopt in vivo characteristic 
Histotypic culture 
Single cell lineage 
Organotypic culture 
Multiple cell lineages 
18 
Experimental Methods 2006 
Sinh học của tế bào nuôi cấy 
Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc : 
Trạng thái tự nhiên của tế bào 
Môi trường nuôi cấy 
Cơ chất tế bào bám 
Thành sinh lí và sinh lí của môi trường nuôi 
Thành phần của phase khí 
Nhiệt độ nuôi 
Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền 
19 
Experimental Methods 2006 
Chu kì tế bào 
M 
Mitosis 
G1 
Gap1 
G2 
Gap2 
G0 
S 
Synthesis 
G1 check point 
 cell big 
 environment suitable 
G2 check point 
 DNA replicated 
 cell big 
 environment suitable 
Metaphase check point 
 chromosome align on spindle 
20 
Experimental Methods 2006 
Chu kì tế bào 
Interphase : 
Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú 
Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước 
Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia 
Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước , tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint 
S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra 
Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới . Có 1 G2 Checkpoint 
  Mitosis hay M Phase: 
Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng 
Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau . 
Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ 
Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia . 
21 
Experimental Methods 2006 
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào 
Kích thích sự tăng sinh 
Mật độ thấp (leaves the cell with free edge) 
Các tín hiệu từ môi trường : các nhân tố phát triển 
Ức chế sự tăng sinh 
Giới hạn mật độ : mật độ tế bào cao 
Kìm hãm tiếp xúc : tương tác tế bào 
Các tín hiệu từ môi trường : p53 gene product 
22 
Experimental Methods 2006 
Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa 
Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các chức năng tế bào bình thường 
Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào : 
Mật độ tế bào cao 
Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào-chất nền 
Chất cảm ứng : hydrocortisone, retinoid, matrix 
23 
Experimental Methods 2006 
Các nhân tố ảnh hưởng đến tính bám dính 
Sự bám dính tế bào là cần thêết cho sự tăng sinh và biệt hóa (signaling through cytoskeleton) 
Các phân tử bám dính tế bào : 
Tương tác tế bào-tế bào : CAMs , cadherins 
Tương tác tế bào-chất nền : integrin , transmembrame proteoglycan 
Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào . 
24 
Experimental Methods 2006 
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính 
Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào 
Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer 
Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa ` 
25 
Experimental Methods 2006 
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào 
Tế bào thích hợp 
Điều kiện thích hợp 
Phase rắn 
Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg . glass, plastic, collagen, agar 
Phase lỏnt 
Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi 
Phase khí 
Nhiệt độ 
Độ vô trùng của môi trường 
26 
Experimental Methods 2006 
Pha rắn 
Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển 
Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic 
Những cơ chất khác như glass, filter wells 
Bề mặt có têể được xử lí với : 
Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine, matrigel 
Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted 
Neurons on glial cell feeder layers 
27 
Experimental Methods 2006 
Phase lỏng 
Thành phần của môi trường 
Muối vô cơ 
Cân bằng áp suất thẩm thấu 
Điều hòa điện thế màng : sodium, potassium và calcium ions. 
Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor. 
Carbohydrate 
Hầu hết chứa 4-20 mM glucose 
Nguồn năng lượng : glycolysis 
28 
Experimental Methods 2006 
Phase lỏng 
Proteins and Peptides 
Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg . transferrin , fibronectin 
Amino acids 
Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa 
glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle 
Fatty Acids and Lipid 
Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt . 
29 
Experimental Methods 2006 
Phase lỏng 
Vitamin 
vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh 
Tiền chất cho các co-factors 
Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin 
Trace Element 
zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates. 
Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do 
30 
Experimental Methods 2006 
Phase lỏng 
Hệ đệm 
Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu : 7.2 - 7.4 
Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu : 
Hệ thống đệm bicarbonate/CO 2 
Hệ đệm hóa chất : HEPES 
Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator 
 vàng (acid) hay hồng (alkali) 
Áp suất thẩm thấu 
Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm 
31 
Experimental Methods 2006 
Phase lỏng 
Huyết thanh 
Nhân tố không xác định : albumins, growth factors và growth inhibitors 
Gia tăng khả năng đệm 
Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc 
Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp 
Biến thiến từng mẻ 
Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm 
32 
Experimental Methods 2006 
Phase khí 
Carbondioxide 
Quan trọng cho hệ đệm 
5-10% CO 2 
Sản xuất sản phẩm : pyruvate 
Oxy 
Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp 
anaerobic glycolysis 
Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do 
33 
Experimental Methods 2006 
Nhiệt độ 
Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài 
Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận 
Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) 
34 
Experimental Methods 2006 
Kĩ thuật vô trùng 
Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào 
Ngăn ngừa sự nhiễm : 
Kháng sinh 
Cải thiện điều kiện PTN 
Kĩ thuật vô trùng 
Bề mặt sạch và gọn gàng 
Người “ sạch ” 
Rửa tay 
Nón , khẩu trang , găng tay 
Hóa chất và môi trường 
Dụng cụ nuôi cấy 
35 
Experimental Methods 2006 
Đông lạnh dòng tế bào 
The aim of cryopreservation is to enable stocks of cells to be stored to prevent the need to have all cell lines in culture at all times 
Reduced risk of microbial contamination 
Reduced risk of cross contamination with other cell lines 
Reduced risk of genetic drift and morphological changes 
Work conducted using cells at a consistent passage number 
Reduced costs (consumables and staff time) 
36 
Experimental Methods 2006 
Đông lạnh dòng tế bào 
Method 
Advantages 
Disadvantages 
Electric (-135ºC) Freezer 
Ease of maintenance 
Steady temperature 
Low running costs 
Requires liquid nitrogen back-up 
Mechanically complex 
Storage temperatures high relative to liquid nitrogen 
Liquid Phase Nitrogen 
Steady ultra-low (-196ºC) temperature 
Simplicity and mechanical reliability 
Requires regular supply of liquid nitrogen 
High running costs 
Risk of cross-contamination via the liquid nitrogen 
- 196ºC 
Vapor Phase Nitrogen 
No risk of cross-contamination from liquid nitrogen 
Low temperatures achieved 
Simplicity and reliability 
Requires regular supply of liquid nitrogen 
High running costs 
Temperature fluctuations between - 135ºC and - 190ºC