Bài thảo luận Enzyme cellulase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANGVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG 
Bài thảo luận 
ENZYME CELLULASE 
GVHD: TS. Vũ Ngọc Bội 
Nguyễn Thị Hoàng Nhạn 
Phạm Tường Vy 
Trần Nguyễn Hạ Huyền 
Đoàn Vũ Trang Đài 
Cao Thị Hòa 
Nguyễn hoàng Hương Quỳnh 
Huỳnh Trần Bích Ngọc 
Phan Thanh Quang 
Dương Quốc Chương 
Nguyễn Minh Sơn 
MỤC LỤC: 
I. TỔNG QUAN: 
Khái niệm . 
Cơ chất 
Nguồn gốc và Phân loại . 
Cơ chế xúc tác 
II. ENZYME endo – β 1,4 – glucanase : 
1.Nguồn thu nhận 
2.Đặc tính enzyme 
3.Nuôi cấy 
4.Thu nhận và tinh sạch 
III. Ứng dụng : 
Tổng quan về enzyme cellulase 
1.Khái niệm : 
	 Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng là glucose. 
Nguồn gốc 
Được thu nhận từ các nguồn khác nhau : 
Động vật : dịch tiết dạ dày bò , các nhóm thân mềm  
Thực vật : trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch , yến mạch , lúa mì mạch đen  
Vi sinh vật : các loại xạ khuẩn , vi khuẩn , nấm sợi , nấm men 
Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật . Các chủng vi sinh vật thường sử dụng : 
Nấm mốc : Aspergillus niger , Aspergillus oryzae , Aspergillus candidus  
Xạ khuẩn : Actinomyces griseus , Streptomyces reticuli  
Vi khuẩn : Acetobacter xylinum , Bacillus Subtilis , Bacillus pumilis  
Cơ chất cellulose 
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật ngoài ra còn có ở TB một số loài VSV, không có trong tế bào động vật . 
Chúng là homopolymer mạch thẳng , được cấu tạo bởi các β -glucose nối với nhau bằng liên kết β -1,4-glucoside. 
 cellulose có cấu tạo sợi , cấu trúc không đồng nhất gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình 
Phân loại theo cơ chế xúc tác 
Endo- β -1,4-glucanase 
EC 3.2.1.4 
Enzyme cellulase 
Exo - β -1,4-glucanase 
β - glucosidase 
1,4- β -D-glucan-4-glucanohydrolase 
EC 3.2.1.74 
1,4- β -D- glucan cellobiohydrolase 
EC.3.2.1.91 
Cơ chế xúc tác : 
II. ENZYME endo – β 1,4 – glucanase : 
Tính chất lý hóa của enzyme 
Enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH=5,5 và nhiệt độ 55 0 C, bền ở 30-45 0 C 
Hoạt tính cao ở pH= 6 
Các dung môi hữu cơ ít ảnh hưởng tới Enzyme này , trừ n- butanol 
Các ion kim loại và EDTA nồng độ 4-12mM đều làm giảm hoạt tính enzyme. 
2. Nguồn thu nhận : 
	Thu nhận từ chủng nấm Aspergillus oryzae ( A.oryzae ). 
	 Thuộc chi Aspergillus , họ Trichocomaceae , bộ Eurotiales , lớp Eurotiomycetes , ngành Ascomycota và thuộc giới nấm . 
Môi trường nuôi cấy : môi trường MTK 
3 ml môi trường khoáng (MTK): 
Peptone: 0.1% 
KH 2 PO 4 : O.2% 
CaCl 2 .2H 2 O: 0,03% 
(NH 4 ) 2 SO 4 : 0.14% 
MgSO 4 .7H 2 O: 0.03% 
Cao nấm men: 0.1% 
Dung dich muối : 1ml ( gồm FeSO 4 : 18mM; MnSO 4 6.6mM; ZnSO 4 .7H 2 O: 4.8mM; CoCl 2 : 15mM; ) 
pH 6.5 khử trùng 
Khả năng sinh endo - β -1,4-glucanase theo thời gian 
 Chủng A.Oryzae VTCC-F-045 được nuôi cấy ttrong môi trường khoáng MTK ở 30 0 C , lắc 200 vòng/phút . Dịch enzyme được thu ở các thời gian khác nhau để xác định hoạt tính endo - β -1,4-glucanase. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120h(2,34U/ml). 
 Các chủng khác nhau thì thời gian tổng hợp endo - β -1,4-glucanase là khác nhau . 
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 
	 Bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy chủng A.oryzae VTCC-F-045, lắc 200 vòng/phút sau 120h 
	 Kết quả : với nồng độ là 1% CMC enzyme đạt hoạt tính cao nhất . 
Ảnh hưởng của nguồn Carbon 
Lactose được đưa vào môi trường nuôi cấy có nồng độ khác nhau nhưng ở nồng độ 0,4% enzyme được cảm ứng sinh tổng hợp cao nhất . 
Ảnh hưởng của nitơ 
Bột đậu tương được đưa vào môi trường với các nồng độ khác nhau sau 120h nuôi cấy nhận thấy rằng ở nồng độ 1% thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme này 
Nhiệt độ nuôi cấy 
Nhiệt độ tối ưu để chủng A.oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp enzyme endo - β -1,4-glucanase cao nhất là 28 0 C. 
Ảnh hưởng của pH 
Mặc dù được nuôi ở các độ pH khác nhau nhưng pH=5.5 khả năng sinh tổng hợp enzyme là cao nhất . 
Xác định hoạt độ enzyme: 
Xác định theo phương pháp định lượng đường khử của Nelson/ Samogi . 
Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đường khử tương đương 1 µl glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm . 
Xây dựng đường chuẩn 
Glucose được pha trong 0,1M đệm Natri acetate, pH =5.0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. 1ml dung dịch glucose chuẩn được đo ở bước sóng 660nm. 
Đường chuẩn glucose 
Ống thí nghiệm : 
dung dịch CMC 0.5% : 0.5ml 
đệm natri acetate 0.1M, pH=5 
dịch enzyme: 0.5ml 
Hỗn hộp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50 0 C sau đó bổ sung chất định lượng đường khử được tạo thành 
Ống kiểm tra : 
dung dịch CMC 0.5%: 0.5ml 
Thêm các chất định lượng đường khử 
dung dịch enzyme: 0.5ml 
Lấy 1ml dung dịch cần định lượng đường khử ở ống nghiệm , thêm 1 ml hỗn hợp muối AB -> đun sôi cách thủy 20 phút , làm lạnh ở nhiệt độ phòng , thêm 1ml dung dịch adenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí . 
Ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa cơ chất còn dư ->so màu ở bước sóng 660nm. 
Mẫu đối chứng thay dung dịch định lượng đường khử bằng nước cất . 
Đối chiếu với đồ thị đường chuẩn suy ra hàm lượng đường khử . 
Quy trình thu nhận enzyme: 
Nguồn thu nhận enzyme( A. oryzae VTCC-F-045) 
Ly tâm 
Dịch chiết 
Kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 
Ly tâm 
Enzym thô 
Tinh sạch và thu nhận 
Dịch enzyme thô 
Ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút 
Dịch trong 
Tủa muối amonium sulfat 65% 
Thẩm tích loại muối 
Qua cột Sephadex G100 
Enzyme tinh sạch 
40 ml dịch nổi sau khi ly tâm 10 phút 12500 vòng/phút được tủa bằng (NH 4 ) 2 so 4 65% và để ở 4 0 C qua đêm . 
Kết tủa thu được hòa với 0.1 M đệm acetate pH=5 và thẩm tích loại muối.Sau khi loại muối , hoạt tính E đạt 24,46U/mg Protein, độ sạch E đạt 1,6 lần so với dịch thô ban đầu . 
Dịch tủa sau khi loại muối cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100. Cột có kích thước 2,6x 60 cm. Cột được cân bằng với đệm phosphate 50mM, pH = 7,5. Tốc độ chảy là 25ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn được thu 2ml ( thu 20 phân đoạn ). 
 Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính E được xác định trong mỗi phân đoạn . 
Sắc kí đồ trên cột sephadex G100 cho thấy protein được phân tách thành 2 peak trong đó peak ở phân đoạn 10 cao nhất , hoạt tính 40,36U/mg protein. 
Các phân đoạn có hoạt tính cao được điện di trên gel 12,5% polyacrylamide với chất chỉ thị phân tử . Sau điện di cho thấy peak 10 xuất hiện một băng đậm , M=36kDa. 
 Độ tinh sạch đạt được gấp 2,6 lần so với enzyme thô ban đầu 
III.Ứng dụng 
1.Trong công nghiệp sản xuất bột giấy 
Trong giai đoạn nghiền cần bổ sung endo - β -1,4-glucanase để làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học . 
Việc bổ sung endoglucanase và hỗn hợp các hemicellulase , pectinase trước khi nghiền hóa học làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin 
2.Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 
 Ví dụ : sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả 
 Bổ sung endoglucanase để tăng hiệu suất trích li dịch quả , giảm bớt độ nhớt , tăng mức cảm quan nước quả 
Sản xuất bia : 
Trong sản xuất bia , dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase  trong đó có cellulase , thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều  kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa . 
3.Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi : 
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột . 
Vì thế,việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật , tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật 
4.Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol,amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân . 
Tuy nhiên , việc bổ sung một số enzym như cellulase,hemicelluase sẽ phá hủy tế bào,giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase,dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng 
5. Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen : 
Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast), có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen:dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ . 
THANKS FOR WATCHING