Báo cáo Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea (pinus caribaea)

 bằng mới phá vỡ trạng thái ngủ của chồi. Đồng thời cytokinin phối hợp với auxin nồng độ thấp 
giúp cho sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. 
Nhưng ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phác thể chồi vừa mới thành lập và kích thích sự 
tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000). Cũng chính vì vậy mà ở nghiệm thức C5 (3mg/l BA: 0,5mg/l 
IBA) xuất hiện mô sẹo ở gốc của chồi con. Môi trường khoáng SH bổ sung 2mg/l BA kết hợp với 
0,2mg/l IBA giúp chồi tăng trưởng tốt (1,82 0,04cm). 
Bảng 3. Sự tạo cụm chồi ngủ trên môi trường SH, sau 10 tuần nuôi cấy 
Nghiệm 
thức 
BA 
(mg/l) 
IBA 
(mg/l) 
Phần trăm 
mẫu tạo chồi 
(%) 
Số chồi/mẫu Chiều cao 
chồi (cm) 
C0 0 0 13,33 2,20±0,45 1,24±0,05 
C1 2 0 40,00 5,40±0,55 1,34±0,05 
C2 2 0,2 50,00 6,80±0,84 1,82±0,04 
C3 3 0 56,67 22,00±1,58 0,52±0,04 
C4 3 0,2 60,00 37,60±0,81 0,82±0,08 
C5 3 0,5 53,33 4,00±0,71* 0,56±0,09 
C6 4 0 43,33 7,40±0,55 0,64±0,05 
C7 4 0,2 46,67 11,00±0,79 1,04±0,09 
(*) Chỉ tính số chồi trước khi mô sẹo hình thành chồi 
Môi trường C5 (3mg/l BA + 0,5mg/l IBA) có sự hình thành mô sẹo từ phần gốc của chồi 
con. Sau 10 tuần mô sẹo có đường kính 1,96 0,15cm. Chúng được cấy chuyền sang môi trường 
SH bổ sung 30g/l glucose, 10% nước dừa và 3mg/l BA kết hợp với 0,2mg/l IBA. Sau 3 tuần nuôi 
cấy, mô sẹo hình thành chồi, sau 6 tuần đạt 20,25 1,5 chồi, có chiều cao 0,63 0,02cm. 
 Dựa trên môi trường C4 (SH bổ sung 3mg/l BA với 0,2mg/l IBA) cho sự hình thành chồi 
tốt, chúng tôi tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo chồi thông Caribê. 
Bảng 4. Ảnh hưởng của đường và nước dừa lên sự tạo cụm chồi thông Caribê trên môi trường 
SH bổ sung 3mg/l BA và 0,2mg/l IBA, sau 10 tuần nuôi cấy 
Nghiệm 
thức 
Tỉ lệ phần trăm mẫu 
cấy phát sinh chồi 
Số chồi/mẫu cấy Chiều cây trung 
bình của chồi 
(cm) 
S 60,00 37,60±0,81 0,82±0,08 
SCW 68,10 43,00±5,42 1,18±0,13 
G 62,25 41,25±4,11 0,93±0,10 
GCW 65,00 112,50±9,57 < 0,5 
Kết quả thí nghiệm cho thấy (Bảng 4), nếu đường sucrose được thay bằng glucose và bổ 
sung 10% nước dừa thì số chồi/mẫu sẽ tăng gấp 3 lần. Glucose cho kết quả tốt hơn sucrose là vì 
glucose tham gia trực tiếp vào con đường biến dưỡng sinh ATP, dinh dưỡng thiết yếu cho tăng 
trưởng và phát triển của cây. Còn sucrose thì phải trải qua một phản ứng thủy giải tạo glucose và 
fructose thông qua enzyme sucrase. Sự kết hợp thêm nước dừa cho hiệu quả tốt hơn vì nước dừa có 
chứa nhiều amino acid, các chất kích thích tố thực vật, đặc biệt là cytokinin, zeatin, myo-inosytol, 
scycle-inosytol. Sau 8–10 tuần nuôi cấy, chồi con ngừng tăng trưởng chiều cao (chỉ đạt 0,5–1cm). 
Nguyên nhân có thể là do sự cạn kiệt dinh dưỡng và sự cạnh tranh dinh dưỡng giữa các chồi. Ngoài 
ra, trên môi trường 30g/l glucose + 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần có sự xuất 
hiện của nhiều búp chồi ngủ, loại vật liệu cho hệ số nhân chồi cao, chính khả năng tạo được 
vật liệu khởi đầu trong diều kiện in vitro sẽ là một yếu tố giúp quy trình nhân giống in vitro 
cây thông Caribê thêm hoàn chỉnh. 
Khảo sát sự tăng trưởng chồi 
Thông qua bảng kết quả (Bảng 5), chúng tôi nhận thấy sự chênh lệch rõ rệch về chiều cao 
của chồi thông trong hai dạng môi trường là bán rắn và lỏng. Chồi được nuôi cấy trên môi trường 
lỏng tăng trưởng tốt hơn và nhanh hơn (SH1: 4,74 0,05cm) so với môi trường bán rắn (SH1: 2,65 
 0,14cm). Môi trường thích hợp hơn hết cho sự tăng trưởng chồi là môi trường SH1 dạng lỏng, bổ 
sung 0,1 mg/l BA, chiều cao chồi đạt 4,74 0,05cm. 
Qua những thí nghiệm trước, chúng tôi nhận thấy sự cạn kiệt dinh dưỡng và nồng độ chất 
điều hòa tăng trưởng thực vật cao có thể là nguyên nhân chính gây ức chế tăng trưởng chồi. Do đó, 
sự đầy đủ về dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp sẽ kích thích chồi 
tăng trưởng. Môi trường SH3 có nồng độ cytokinin cao (BA: 0,5mg/l) ức chế sự kéo dài thân, nên 
chồi có chiều cao thấp hơn so với chồi trên môi trường khác. Đạt được hai yêu cầu thiết yếu về dinh 
dưỡng và chất điều hòa tăng trưởng, môi trường SH1 chứng tỏ phù hợp nhất để tăng trưởng chồi. 
Trong môi trường SH0, tuy không có chất chất điều hòa tăng trưởng nhưng chồi vẫn tăng trưởng, 
nhưng chậm hơn so với môi trường SH1 và SH2, vì môi trường này chỉ đảm bảo về nhu cầu dinh 
dưỡng, thiếu hụt hẳn lượng hoormone ngoại sinh. 
Bảng 5. Sự tăng trưởng của trên môi trường SH bổ sung các nồng độ BA khác nhau, ở 
hai dạng bán rắn và lỏng sau 4 tuần nuôi cấy 
Chiều cao trung bình (cm) Nghiệm 
thức 
BA 
(mg/l) Môi trường bán rắn Môi trường lỏng 
SH0 0 2,55±0,10 3,13±0,08 
SH1 0,1 2,65±0,14 4,74±0,05 
SH2 0,2 2,62±0,12 4,43±0,08 
SH3 0,5 2,14±0,10 2,41±0,14 
Tạo rễ chồi thông Caribê in vitro và chuyển cây ra vườn ươm 
Với phương pháp tạo rễ thông qua hai giai đoạn: (1) Cảm ứng tạo rễ sơ khởi trên môi trường 
bán rắn, có nồng độ auxin cao (0–5mg/l IBA), ủ tối trong 2 tuần và (2) kích thích kéo dài rễ trên 
môi trường auxin có nồng độ thấp (0,1mg/l IBA) trong 6 tuần tiếp theo, chúng tôi đã thu được kết 
quả khả quan như sau: 
Bảng 6. Sự tạo rễ của chồi trên môi trường SH1/2, sau 8 tuần nuôi cấy 
Nghiệm 
thức 
IBA 
(mg/l) 
Tỉ lệ 
mẫu cấy 
ra rễ 
(%) 
Thời gian 
xuất hiện 
rễ (tuần) 
Số rễ/cây Chiều dài 
rễ (cm) 
Ghi chú 
R0 0,0 0 0 0 0 
R1 0,2 0 0 0 0 
R2 0,5 40 6 5,43±0,53 0,94±0,15 Có 10-12 rễ nhánh 
R3 1,0 80 4 1,57±0,53 2,69±0,24 Có 3-4 rễ nhánh 
R4 1,5 70 4 5,57±0,53 2,03±0,37 Không rễ nhánh 
R5 3,0 30 4 1,93±0,45 1,96±0,21 Không rễ nhánh 
R6 5,0 0 0 0 Mẫu chết 
Kết quả cho thấy môi trường R3 và R4 có thể sử dụng cho mục đích ra rễ (Bảng 6). Trong 
đó R3 là môi trường thích hợp hơn vì sau 8 tuần nuôi cấy đạt 80% chồi thông ra rễ; mỗi cây có 1,57 
 0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. Ở các môi trường R0, R1 có nồng độ auxin chưa đủ cao để kích 
thích sự hình thành rễ sơ khởi từ chồi in vitro. Đối với môi trường R2, nồng độ IBA là 0,5mg/l có 
thể kích thích sự hình thành rễ từ chồi nhưng tỷ lệ vẫn còn thấp. Nghiệm thức R5, môi trường có 
lượng auxin cao (3mg/l IBA) ức chế sự tạo rễ nên tỷ lệ giảm so với R3 và R4. Môi trường R6, nồng 
độ auxin quá cao (5mg/l IBA) làm mẫu chết sau hai tuần ủ tối. Chúng tôi nhận thấy quy trình này có 
hiệu suất tạo rễ và số rễ mỗi cây cao hơn so với quy trình sử dụng IAA và IBA của Trần Văn Minh 
(2003) (chỉ tạo được một rễ) và quy ảtình chưa tạo được rễ của tác giả Phạm Thị Kim Thanh (2007) 
 Cây con ra rễ sẽ có tỷ lệ sống ngoài vườn ươm lần lượt là 90% cho cây 8 tuần tuổi và 100% 
cho cây 14 tuần tuổi. Tuần đầu tiên, thực hiện phun sương theo chu kỳ 60 phút, thời gian phun là 2 
phút. Tuần thứ hai trở đi chỉ tưới mỗi ngày 3 lần, sau 30 ngày bón phân N–P–K (16–16–8), liều 
lượng 3g trong 1 lít nước. Việc bổ sung thêm đất rừng thông vào giá thể còn là điều kiện cho nấm rễ 
tương tác với thông con, giúp cây phát triển và thích ứng tốt. 
KẾT LUẬN 
 Vật liệu khử mẫu thích hợp: đoạn chồi non 3 tuần tuổi mang búp chồi. 
 Phương thức khử mẫu tốt nhất: Tiền xử lý, ngâm trong citric acid 0,5% (30 phút) và benzoic 
acid 0,25% trong 60 phút. Tỷ lệ javel thích hợp cho bước khử mẫu tiếp theo là (1 javel: 3 nước). 
 Môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA + 0,2mg/l IBA thích 
hợp tạo cụm chồi và tái sinh chồi từ mô sẹo. Tạo búp chồi con trên môi trường SH có 30g/l glucose 
+ 10% nước dừa + 2mg/l BA + 0,5mg/l IBA sau 6 tuần. 
 Môi trường SH lỏng bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 0,1mg/l BA thích hợp cho 
tăng trưởng chồi. 
 Môi trường bán rắn SH1/2 bổ sung 1mg/l IBA giai đoạn 1 thích hợp cho việc tạo rễ sơ khởi 
rễ. Kết hợp với giai đoạn 2 sử dụng môi trường SH1/2 bổ sung 0,1mg/l IBA để kích thích kéo dài rễ. 
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, mỗi cây có 1,57 0,53 rễ và rễ dài 2,69 0,24cm. 
 Cây con 8 tuần tuổi chuyển ra vườn ươm sống 90%. Cây 14 tuần tuổi sống 100%. 
 Hệ số nhân chồi trong môi trường SH bổ sung 30g/l glucose + 10% nước dừa + 3mg/l BA + 
0,2mg/l IBA là 112 chồi/ mẫu sau 10 tuần. Vậy hệ số nhân chồi lý thuyết là 1125 chồi/ năm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Thương, Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, 2003. Bước đầu 
nhân nhanh giống thông Caribê (Pinus caribaea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Báo 
cáo khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 880 
– 883. 
Trần Văn Minh, Hà Thị Loan, 2003. ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phát triển cây 
nguyên liệu giấy thông Caribê (Pinus caribaea). Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong 
khoa học sự sống. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần 2. Nghiên cứu cơ bản trong sinh 
học, nông nghiệp, y học. NXB Khoa học Kỹ thuật. Trang 372 – 376. 
Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II. Tủ sách trường Đại học Khoa học 
Tự nhiên. Trang 78 – 110. 
Phạm Thị Kim Thanh, Huỳnh Đức Nhân, 2007. Nhân giống thông Caribê (Pinus Caribaea) 
bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 
Số 12+13. Trang 91-94. ISSN 0866-7020 
IN VITRO PROPAGATION OF CARIBEAN PINE (PINUS CARIBAEA) 
Kieu Phuong Nam, Cao Quoc Liem, Tran Trung Hieu, Bui Van Le 
 Department of Biology, University of Science, Ho Chi Minh city 
Kieu Thanh Tinh 
Centre of South Eastern Forest Science and Production, Forest Science Institute of Vietnam 
SUMMARY 
Our aim in this study is to reveal the role of three factors that dramatically 
affect the efficacy of in vitro propagation process of Pinus caribaea. These 
are: 1. the effect of increasing effectiveness of sterilization of benzoic 
acid treatment (93.33%); 2. for the initial step of the process, young shoots 
carrying bud dormancy are the most suitable material, which can be obtained on 
SH medium with 30g/L glucose: 10% coconut water, 2mg/L BA, 0.5mg/L IBA; and 
finally; 3. an increase in root development can be achieved through hormone 
shock (80%). 
Keywords: Vitro propagation, Pinus caribaea 
Hình 1: Quy trình nhân giống in vitro cây thông caribaea