Đề tài Dòng hóa và chuyển gen ở bò

TotipotentPluripotentMultipotentDifferentiated2-4 tế bào*Sự phát triển của phôi*2. Các kỹ thuật dòng hóa	Embryo cloning là kỹ thuật sử dụng tế bào cho nhân là tế bào pluripotent (tế bào giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu).	Somatic cloning là kỹ thuật sử dụng tế bào cho nhân là tế bào sinh dưỡng (somatic cell). Tế bào sinh dưỡng là bất cứ tế bào nào hình thành nên các cơ quan, bao gồm cả tế bào biệt hóa và các tế bào gốc (organ stem cell).*II. Dòng hóa3. Quy trình* Chuẩn bị, xử lý tế bào cho nhân và trứng nhận Đồng pha tế bào Tái kết cấuNuôi cấy và chuyển phôiII. Dòng hóaKỹ thuật chuyển nhân trong cloning*3. Quy trình3.1. Thu nhận tế bào cho nhânEmbryo cloning	*II. Dòng hóaPhôi nang/ phôi dâuIn vitro/ in vivoPhôi mất màng trong suốtThu tế bào đơnProteaseỦ với môi trường không Ca , 15 phútLấy phôi bò *3. Quy trình3.1. Thu nhận tế bào cho nhânSomatic cloning: Có thể được lấy từ nhiều bộ phận khác nhau Có thể lấy từ thú ở mọi lứa tuổi, hay từ thú đã chết vài giờ. Mức độ biệt hóa của tế bào cho khó xác định rõ ràng.*II. Dòng hóa3. Quy trình3.1. Thu nhận tế bào cho nhân:Somatic cloning	Thu tế bào biểu mô sau tai:	 → Cạo lông 	 → rửa dd sát khuẩn 	 → cắt một mảnh da 	 → ngâm qua cồn 70o 	 → bảo quản trong dd saline vô trùng ở 4oC*II. Dòng hóa3. Quy trình3.1. Thu nhận tế bào cho nhân:Somatic cloning	*II. Dòng hóaRửa, cắt, xử lý enzymeSau vài tuần, tách bằng trypsinTế bào đơnDung dịch tế bào loãngTế bào cho nhânBảo quảnNuôi trong môi trường lỏngMẫu tế bàoHuyết thanh,chất chống đông3. Quy trình 3.2. Thu nhận và chuẩn bị trứng*II. Dòng hóaBuồng trứng từ lò mổTrứng-tế bào ổ (cumulus-oocyte COC)TrứngCOC ở giai đoạn MIITrứng không nhânMàng trứng mềmNhuộm NST,ức chế cytoskeletonTrưởng thành in vitroHút ở hốc nang noãn có xoangLoại bỏ tế bào ổ bằng enzymeHút nhânSự trưởng thành của nang noãnNang noãn có xoang của bò3. Quy trình3.3. Đồng pha tế bào: Đưa nhân và trứng về cùng pha tạo điều kiện cho tái kết cấu thành công. Nguyên nhân:MPF (maturation promoting factor) của trứng tác động lên nhân cho.Nhân không cùng pha với trứng → MPF tác động sai lệch lên nhân → bất thường ở nhân: vỡ màng nhân, NST cô đặc, tạo thể đa bội*II. Dòng hóa3. Quy trình3.3. Đồng pha tế bào	Embryo cloning	Hoạt hóa trứng nhận Tăng thời gian nuôi cấy trứng Giảm nhiệt độ môi trường (10oC) Xung điện Ức chế tổng hợp protein Hóa chất: Calcium Ionophore A23187, ethanol.	(Protocol: 5 μM ionomycin 5’ → 1,9 mM DMAP 3h)	Nhược điểm: 	Có thể làm giảm khả năng tái lập chương trình 	nhân của tế bào chất trứng.*II. Dòng hóa3. Quy trình3.3. Đồng pha tế bào	Somatic cloning	 Cảm ứng tế bào cho	Nuôi ngắn hạn với môi trường không yếu tố tăng trưởng hoặc huyết thanh đói→ tế bào cảm ứng vào giai đoạn G0/G1	 Có thể kết hợp với hoạt hóa trứng	Nhược điểm: 	Dễ gây chết tế bào theo chu trình.*II. Dòng hóa*3. Quy trình 3.4. Tái kết cấu Giúp nhân cho vào nguyên sinh chất của tế bào nhận Tái kết cấu bằng vi tiêm trực tiếp Tế bào cho: → phá màng bằng cơ học hay hóa học. → tiêm trực tiếp vào tế bào chất trứng nhận. Ưu điểm: giảm thiểu DNA ty thể tế bào cho. Nhược điểm: Gây chấn động nhân, giảm tỷ lệ sống, khó thực hiện, nhất là với tế bào cho lớn (tế bào sợi)*II. Dòng hóa3. Quy trình 3.4. Tái kết cấu Tái kết cấu bằng xung điện	Tế bào cho: → dưới màng trong suốt → môi trường hợp nhất Zimmerman → tạo hai đợt xung điện, cường độ và tần số 	tùy thuộc loại tế bào → lặp lại mỗi 15’ cho đến khi hợp nhất.	Có thể tăng hiệu suất quá trình bằng cách tăng nhiệt độ hoặc tạo môi trường nhược trương*II. Dòng hóa*3. Quy trình 3.5. Nuôi cấy và chuyển phôi Phôi nuôi in vitro 	→ phôi nang 	→ chuyển phôi vào thú mang thai hộ hoặc đông lạnh Thú nhận phôi 	→ phối với thú đực thiến 	→ ngày 0 của mang thai giả (đóng hàn cổ tử cung) 	→ phẫu thuật chuyển phôi 	→ tạo điều kiện mang thai (bổ sung kích thích tố)*II. Dòng hóa3. Quy trình3.5. Nuôi cấy và chuyển phôi*II. Dòng hóaThú nhận phôiNgày 0 của mang thai giảSinhThú mang thai hộPhôiĐông lạnhPhôi nangNuôi in vitroPhối với thú dực thiến Kích thích tốPhẫu thuật chuyển phôi4. So sánhEmbryo cloningSomatic cloningTế bào choPluripotentMultipotent/DiffentiatedNuôi cấy tế bào choKhôngCóĐồng pha tế bàoHoạt hóa trứngCảm ứng tế bào cho*II. Dòng hóa4. So sánh*II. Dòng hóaEmbryo cloningSomatic cloningSố lượng tế bào choÍt, giới hạnNhiều, đa dạngKhả năng thành côngCao hơn Thấp hơn Kiểu hình cloneKhông biếtBiếtBảng: Phát triển in vitro của phôi chuyển nhân từ TB nguyên xơ bò (nuôi cấy trong 2 loại môi trường)*Môi trườngNguồn tế bàoTB chất nhận khi hợp nhấtSố phôi hợp nhấtTỷ lệ phôi nang (%)Tế bào nguyên xơ trong môi trường không đóiThaiThời kỳ chuyển tiếp11610 (8,6)MII678 (12)MII17435 (20)Thú trường thànhThời kỳ chuyển tiếp39112 (3,1)MII10228 (28)MII10228 (28)MII15249 (32)Tế bào nguyên xơ trong môi trường đóiThaiThời kỳ chuyển tiếp27523 (8.4)MII7331 (43)MII20580 (39)Thú trưởng thànhThời kỳ chuyển tiếp34312 (3.5)MII8825 (28)MII11424 (21)MII12444 (35)Bảng: Phát triển của phôi đến khi sanh với TB nguyên xơ bò (nuôi cấy trong 2 loại môi trường)*Môi trườngNguồn tế bàoSố phôi nang chuyển cấySố thai vào ngày 30 (%)Số thú con (% so với số phôi nang)Tế bào nguyên xơ trong môi trường không đóiThai163 (18,7)2 (12,5)2072 (28,6)2 (28,6)Thú trường thành181 (5,5)1 (5,5)122 (16.7)015014834 (22,3)7 (4,7)Tế bào nguyên xơ trong môi trường đóiThai435 (11,6)2 (4,6)305 (16,7)01690Thú trưởng thành111 (9,0)0144 (28,6)1 (7,1)153 (20,0)0249 (37,5)1 (4,2)Bảng: Phát triển của phôi chuyển nhân từ các nguồn tế bào trưởng thành ở bò*Loại môSố phôi tái kết cấu (%)Số phôi nangBê sanh (%)Tồng số (%)Chuyển cấyỔ noãn (cumulus)47 (47)18 (49)65 (83)TB hạt (granulosa)552 (77)152 (27)10010 (10)Biểu mô (ống dẫn trứng)94 (63)20 (23)43 (75)Biểu mô (tuyến vú)140 (63)25 (18)4 1 (25)TB nguyên xơ (da)840 (70)159 (19)1339 (6,8)Bạch cầu (máu)698 (79)124 (18)501 (2,0)**III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bòTrong công tác giống Tạo đời con của bò đực ưu việt.	Tạo bò cái xuất sắc để cải thiện di truyền	Dòng hóa cũng áp dụng ở bò thịt**Bò cái ưu việt Holstein Friesian và bò con được dòng hóa từ tế bào hạt của nang noãn.III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò.2. Dòng hóa các thú có nguy cơ Gaur Noah*III. Khả năng áp dụng của dòng hóa bò3. Bò dòng hóa như mô hình thú Nghiên cứu bệnh lý Nghiên cứu hành vi khi cung cấp các loại thức ăn khác nhau cho thú*IV. Chuyển gen và dòng hóa	Chuyển gen:	Là đưa một đoạn DNA ngọai lai vào tế bào và làm cho nó biểu hiện.	Yêu cầu:	Gen được chuyển là một phân tử DNA tái tổ hợp chứa ít nhất 2 phần: Phần điều hòa hay khởi độngPhần cấu trúc.*1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóaThông qua quá trình dòng hóa như thế nào? Dòng hóa tạo một lượng lớn hợp tử và chuyển gen trực tiếp vào nó.Tạo nhiều phôi để chuyển gen và thu nhận nhân từ phôi đã chuyển gen để dòng hóa.*IV. Chuyển gen và dòng hóa1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA *IV. Chuyển gen và dòng hóaQuy trình chuyển gen ở bò*1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA Khó khăn: Đoạn DNA đưa vào TB nhận bị xóa hay biến đổi. Nguyên nhân: Các đoạn DNA ngắn thường bị phân cắt bởi DNase ở tế bào chất. Trong nhân các đoạn ngắn có xu hướng tái tổ hợp tương đồng.*IV. Chuyển gen và dòng hóa1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa1.1 Chuyển gen thông qua vi tiêm đoạn DNA Khó khăn:	DNA lạ khi tiêm vào sẽ liên kết một cách ngẫu nhiên, dẫn đến sự biểu hiện sai lầm của gen. 	Nguyên nhân:	Theo cơ chế sửa sai DNA của tế bào, đoạn DNA ngoại lai sẽ sát nhập ở dạng không tương đồng và tương đồng.*IV. Chuyển gen và dòng hóa 1.2 Chọn gen đích trong dòng hóa Đưa gen vào một vùng chọn lọc của bộ gen tạo nhiều ưu thế Sự sát nhập gen ngoại lai vào gen tế bào chủ dễ dàng hơn Tỷ lệ biểu hiện cao hơn Có thể loại bỏ hay bất hoạt một gen mong muốn Dòng tế bào mang phải được nuôi cấy trong thời gian dài Có khả năng tạo nên đời con sau khi biến đổi.*IV. Chuyển gen và dòng hóa1. Tạo thú chuyển gen thông qua dòng hóa2. Dòng hóa để cải thiện chuyển gen Tế bào nguyên xơ được cấy truyền qua 15 lần trước khi chuyển nhân giúp tế bào ở giai đoạn sẵn sàng để chuyển gen chọn lọc dòng tế bào biến đổi để lấy nhân Tạo tế bào khảm hoặc thú khảm. *IV. Chuyển gen và dòng hóa*3. Áp dụng của chuyển gen Ức chế tạo beta lactoglobulin trong sữa bò Tăng lượng casein trong sữa Thay đổi thành phần béo trong sữa Giảm lactose trong sữa Nâng cao lượng lactoferrin và lysozyme Loại bỏ gen không cần thiết như gen tạo protein PrP*IV. Chuyển gen và dòng hóaV. Tổng kếtDòng hóa đã mở ra nhiều triển vọng hơn trong nghiên cứu hay bảo tồn động vật có nguy cơTuy nhiên khả năng thành công ở động vật lớn như bò, cừu, chưa caoQuy trình dòng hóa cần nghiên cứu nhiều hơn để hiểu rõ cơ chế và chuẩn hóa chung.Sự kết hợp dòng hóa và chuyển gen mở ra khả năng loại bỏ hay gắn thêm gen đem đến nhiều ứng dụng to lớn*Tài liệu tham khảoTrần Thị Dân, 2006, Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, Chương 10, Nhà xuất bản nông nghiệp.Peter Sutovsky, 2007, ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, Volume 591 SOMATIC CELL NUCLEAR TRANSFER, Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, U.S.A.Michael J. Fields, Robert S. Sand • Joel V. Yelich, 2002, FACTORS AFFECTING CALF CROP - Biotechnology of Reproduction, CRC Press LLC, Boca Raton, Florida, U.S.A.Tatsanee Suteevun, 2005, EPIGENETICS OF CLONED SWAMP BUFFALO EMBRYOS, CLONED CATTLE FETUSES AND CALVES*Tài liệu tham khảoTrần Keith E. Latham and Mark E. Westhusin, Transplantation and Cloning in Mammals, Rocky S. Tuan, Cecilia W. Lo (Editor), 2000, Nuclear Methods in Molecular Biology, Volume 136 - Developmental Biology Protocols Volume II, Humana Press, Clifton, New Jersey, U.S.A. Jose Cibelli, Robert Lanza, Keith Campbell, Michael D. West, 2002, Principles of Cloning, Academic Press, London, EnglandLouis-Marie Houdebine, 2001, Transgenèse Animale et Clonage, Louis-Marie Houdebine, Christine Young, Gail Wagman, Kirsteen Lynch (Translator), 2003, Animal Transgenesis and Cloning, John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex, England