Đề tài Tin Sinh học: Tìm hiểu thông tin sinh học về gen cystatin ở cây đậu côve liên quan đến khả năng chịu hạn

í quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp ở Việt nam và nhiều quốc gia khác trên thế giới.Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính chịu hạn ở cây đậu này đó chính là gen Cystatin. I. GIỚI THIỆU CHUNG  Cystatin và gen cystatin được xác định có liên quan với khả năng chịu hạn của thực vật và đã được nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng khác nhau như đậu côve, đậu xanh, lúa, cây Arabidopsis, lúa mạch, đậu tương Tính chịu hạn ở thực vật thường là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress cùng hoạt động đồng thời. Gần đây, có một số nghiên cứu đã phân lập gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật, trong số đó có đề cập đến gen cystatin. II. GEN CYSTATIN: Cystain là chất ức chế có bản chất protein. Sự biểu hiện của các gen cystatin thường trong điều kiện hạn, lạnh,mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật. Pernas M. và cs(2000) cho rằng khi rễ cây dẻ( Castanea sativa) gặp lạnh,sốc muối,stres nóng thì mức độ phiên mã tăng mạnh ở cả tế bào rễ và tế bào lá, cystatin ở cấy dẻ không chỉ liên quan đến khả năng chống lại tác động bất lợi của môi trường. (IRGSP) tại Viện nghiên cứu bộ gen (TIGR; Cystatin trình tự gen ở cây Phaseoli vulgaris Leguminosae đã được xác định bằng cách tìm kiếm Các Phaseoli vulgaris Thông tin tài nguyên (TAIR) cơ sở dữ liệu ( Phaseoli vulgaris .org). Trình tự cho Phaseoli vulgaris được lấy từ các bộ gen nguyên Shotgun trình tự dự án của Genomics Bắc Kinh Viện (NCBI  BLAST / gen / PlantBlast.html) và tìm kiếm bằng cách sử dụng mặc định các thông số.  Tìm kiếm các gen cystatin lúa mạch mới được thực hiện trong lúa mạch công khai các thư viện EST có sẵn bằng cách sử dụng Protein truy vấn dịch cơ sở dữ liệu (tblastn) với các thông số mặc định. ESTs lựa chọn đã thu được từ các thư viện cDNA xây dựng cho Hordeum vulgare L. Trường Đại học Clemson Viện Genomics, Clemson, S.C. (CUGI, edu / dự án / lúa mạch). Trình tự nucleotide xác định trên cả hai sợi bằng cách sử dụng vector-mồi cụ thể và một bộ sắp xếp dãy DNA tự động (ABI PRISM TM 3100; Applied Biosystems).III. KẾT QUẢ TÌM KIẾMPhân tích trình tựSự sắp xếp của các chuỗi protein đã được thực hiện tạiNgân hàng dữ liệu DNA của Nhật Bản ( sử dụng chương trình CLUSTALW (Higgins và cộng sự năm 1994.) với các thông số mặc định. Tín hiệu peptide đã được phân tích thực hiện bằng cách sử dụng 3.0 Phiên bản SignalP ( / dịch vụ / SignalP) chương trình (Bendtsen et al. 2004). Bootstrapping phân tích với một PHYLIP đầu ra 'cây' định dạng được thực hiện sau khi xây dựng cây theo phương pháp tham gia láng giềng, và các cây đại diện bằng cách sử dụng TreeView (Version1.6.6) phần mềm (1996). Bảo tồn được thực hiện phân tích motif phương tiện của chương trình ( Cơ sở dữ liệu GenBank EST (dbEST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov / dbEST / index.html) bằng cách sử dụng tblastn chương trình và các thông số mặc định. các mục xác định được kiểm tra nguồn gốc mô tại GenBankcơ sở dữ liệu trình tự nucleotide.IV. CÁC BƯỚC TÌM KIẾM THÔNG TIN SINH HỌC TRÊN INTERNET CHO GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU CÔVE:Trong bài này chúng ta sẽ tìm kiếm thông tin bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu trong trang chu NCBI ( National Center for Biotechnology Information- NCBI, USA) tại địa chỉ Internet là  Khi truy cập vào địa chỉ này, chúng ta sẽ nhìn thấy một trang chủ dạng như sau:Chúng ta thực hiện tìm kiếm thông tin sinh học trong trang Entrez. Trang Entrez là một trang web của NCBI.• Nhấn dòng chữ Entrez để vào trang Entrez.Trong Entrez, chúng ta có thể tìm kiếm nhiều dạng cơ sở dữ liệu khác nhau. Mỗi cơ sở dữ liệu là một liên kết được biểu thị bằng dòng văn bản được đổi màu khi ta di chuyển đến. Ví dụ: PubMed, Protein... Các dòng văn bản đổi màu được gọi là các liên kết siêu văn bản (hay liên kết) và thường mở ra một trang mới khi ta nhấn vào. Trong Entrez chúng ta có thể nhập vào những yêu cầu tìm kiếm cơ sở dữ liệu về các bài báo thuộc lĩnh vực Y – Sinh học (PubMed), trình tự nucleic acid (Nucleotide), trình tự protein (Protein), cấu trúc sử dụng trang PubMed để tìm kiếm các bài báo về thông 3 chiều (Structure), bộ gen (Genome) Ở đây, chúng ta tìm tin liên quan đến cây đậu côve.Bao gồm các thao tác sau đây:IV.1.TÌM KIẾM TRÌNH TỰ SINH HỌC 	4.1.1 Tìm trình tự ADN	Để tìm những trình tự DNA ta sử dụng Entrez Nucleotide để tìm kiếm trong hệ thống cơ sở dữ liệu về trình tự DNA. Các cơ sở dữ liệu này bao gồm hệ thống GenBank (NCBI, USA) và liên kết với cơ sở dữ liệu của EMBL, DDBJ và một số hệ thống dữ liệu khác trên thế giới.	• Từ trang PubMed, nhấn vào dòng Nucleotide để đưa ta đến trang Entrez Nucleotide.	• Nhập vào yêu cầu (thường là tên gen như: Cystatin gene. Đây là gen chịu hạn ở đậu côve) và nhấn nút Go (hoặc nhấn Enter?).	• Kết quả sẽ xuất hiện một danh sách trình tự DNA tương tự như sau:Hoặc nhấp vào Fasta ta có được trình tự nucleotit của gen Cystatin4.2.2. Tìm trình tự Protein	Để tìm trình tự protein, cũng tương tự việc tìm kiếm trình tự DNA. Việc tìm kiếm trình tự protein cũng được thực hiện trong hệ thống Genbank, EMBL và DDBJ.	• Nhấn vào dòng Protein trong trang Entrez để mở trang Entrez Protein.	• Nhập vào yêu cầu (thường là tên protein như: “SSB”, “ST”,) và nhấn nút Go (hoặc nhấn Enter?).	• Sau vài phút, kết quả sẽ xuất hiện một danh sách trình tự protein tương tự như trường hợp DNA.	• Nhấn vào mã số truy cập của các mục bài để xem chi tiết trình tự protein.Tìm trình tự protein :• Trở về trang Entrez hoặc từ trang Entrez Nucleotide, nhấn vào dòngProtein để mở trang Entrez Protein.Trang Entrez protein sẽ xuất hiện có dạng:Chúng ta thực tập tìm kiếm trình tự protein là cystatin • Nhập dòng “cystatin” vào khung yêu cầu, nhấn Go, và chờ kết quả.Nhấp chuột vào FASTA ta có trình tự axit amin của protein Cystatin như sau:Muốn lưu trình tự nu này ta vào send –file- create File, chọn đuôi FASTA để lưu và sử dụng so sánh trình tự nu. Ta chọn 4 kết quả để lưu file so sánh trình tự nu ở mục sau.V. TÌM KIẾM CÁC TRÌNH TỰ TƯƠNG ĐỒNG5.1. Nucleotide – Nucleotide BLAST	Tìm một đoạn trình tự DNA Cystatin mà ta đã lưu• Mở chương trình BLAST bằng cách nhấn vào dòng BLAST trong các trang của NCBI. Mở chương trình Nucleotide BLAST bằng cách nhấn lên dòng blastn.• Chép trình DNA tự trong tập tin vào khung nhập trình tự(Search). Lựa chọn chức năng blastn và nr, đặt chiều dài giới hạn từ 1 đến 200 trong mục From và To, chọn others (so với các loài khác)• Nhấn nút BLAST! để bắt đầu chương trình.Kết quả sẽ hiện lên trang formatting BLAST.• Nhấn vào nút Format! để mở trang kết quả tìm kiếm và chờ đợi (có thể kéo dài vài phút hoặc lâu hơn). Tiếp tục kích vào ô View report ta được bảng sau:5.2. Protein – Protein BLASTMở thư mục GHD7-protein chứa trình tự protein GHD7đã lưu.• Mở trang Protein BLAST bằng cách nhấn vào dòng blastp trong trang BLAST.• Trong hộp nhập thông tin (Search), chép trình toàn bộ trình tự amino acidtrong tập tin GHD7 -protein. Chọn trình tự BLAST (ví dụ từ 1 đến 60), chọn cơ sở dữ liệu là nr.•Tiếp tục nhấn vào nút BLAST!, một cửa sổ mới sẽ xuất hiện.• Nhấn vào nút Format! để mở trang kết quả tìm kiếm và đợi đến khi xuất hiện kết quả.VI. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA- TÌM KHUNG ĐỌC MỞ ORFChúng ta thực hành xác định khung đọc mở của trình tự gen Cystatin. Mở tập tin nu đã lưu.• Mở trang ORF finder từ trang chủ NCBI.• Chép trình tự DNA trong tập tin Cystatin–nu (dạng tập tin văn bản text) vào hộp trình tự (sequence in FASTA format).• Lựa chọn dịch mã từ 1 đến 1000 và mã di truyền là Genetic code.• Nhấn nút OrfFind để thực hiện chương trình.Kết quả có sáu bản dịch xuất hiện và mỗi bản là một khung đọc mở. Cystatin là một protein có mạch polypeptide là 186 amino acid. Muốn xem cụ thể khung đọc mở nào ta kích vào ô xanh đó (ví dụ khung +1), Nhấn lên trình tự khung đọc mở sẽ thấy hiện lên trình tự DNA và trình tự dịch mã amino acid.VII. SO SÁNH TƯƠNG ĐỒNG VÀ TẠO CÂY PHÁT SINH LOÀI TỪ TRÌNH TỰ DNA ClustalX là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồngnhiều trình tự DNA. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bật những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng. TreeView là một phần mềm dùng để vẽ cây phát sinh loài. Phần mềm này thực hiện đọc kết quả so sánh từ những tập tin dạng NEXUS (NEXUS tree) của các chương trình PAUP và COMPONENT NEXUS hoặc những tập tin dạng PHYLIP (PHYLIP tree) của các chương trình fastDNAml, ClustalX và ClustalW. 	Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí trình tự giống nhau sẽ được thể hiện cùng một màu sắc (mỗi loại nucleotide một màu) và được đánh dấu * là vị trí giống nhauTa có thể nhận xét mức độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương đồng về màu sắc và dạng đồ thị bên dưới. • Mở chương trình ClustalX trên desktop.• Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode.• Chọn trình tự trong tập tin đa õlưu ở trên.• Nhấn nút Open. Chọn do complete alignment.gi|1498132|dbj|D63342.1| Zea mays DNA for cysteine proteinase inhibitorgi|4520364|dbj|AB009341.1| Oryctolagus cuniculus mRNA for cystatingi|23496471|dbj|AB083088.1| Gorilla gorilla CSTB gene for cystatingi|58296|emb|X62413.1| Synthetic chicken cystatin genegi|58080|emb|X12763.1| Artificial cDNA for human cystatingi|60391338|dbj|D88422.2| Homo sapiens gene for cystatingi|33112006|tpg|BK001265.1| TPA_exp: Mus musculus cystatingi|76803850|gb|DQ196188.1| Triticum aestivum cultivar HD 29 cystatin genegi|4929215|gb|AF143677.1| Artemisia vulgaris cysteine proteinase inhibitorgi|1944341|dbj|D64115.1| Glycine max DNA for cysteine proteinase inhibitorSo sánh trình tự AND của 10 loài sau đây đều có chứa gen Cystatin	Mở chương trình ClustalX trên desktop. Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode. Từ menu File, chọn Append Sequences. Trong hộp Open, chọn tập tin chứa các trình tự cần so sánh. Nhấn nút Open. Chọn Do Complete Alignment trong menu Alignment. Xác định vị trí cho tập tin xuất rồi nhấn nút Align.Qua sơ đồ này ta nhận thấy rằng một số loài ở cả thực vật và thực vật đều chứa gen Cystatin thế nhưng gen này ở đậu coove lại có mối quan hệ gần gũi với cây Arabidopsis (cải Xoang), đậu tương, lạcXIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN