Đề tài Tin Sinh học: Ứng dụng Tin sinh học trong định danh và xác định enzyme chitinase trên Trichoderma

 đối kháng có thể ức chế nấm đất gây hại thực vật được sử dụng phổ biến nhất. Rất nhiều giống Trichoderma có khả năng kiểm soát nhiều loài nấm gây bệnh. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium. Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm được trao đổi của Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập được chất kết tinh rất độc khi dùng Trichoderma chống R.solani. Chất này tên thông thường là gliotoxin. Chất độc thứ 2 do Brian và Mc Growan công bố là viridin sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. có sản phẩm kháng, khác với gliotoxin và viridin, sản phẩm đó là chất kháng sinh, có thể hòa tan được trichlorofore từ các chủng T.viride và T. polysporum và 1 chất kháng peptid từ T. hazianum.Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết ra nhiều enzyme khác như exo và endoglucanases, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh. Nấm Trichoderma cũng như một số nấm mốc khác như Gliocladium, Calvatia cho lượng enzym chitinase cao. Chitinase có nhiều chức năng, một trong những chức năng chính là khả năng phân hủy chitine là thành phần chất dính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố rất quan trọng trong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật. Qua các báo cáo trên ta có thể nhận thấy rằng việc định danh Trichoderma là cần thiết để có thể chọn đúng loài có khả năng đối kháng cao và tiết enzyme chitinase cao.Trong các phương pháp định danh vi sinh vật thì hiện nay phương pháp định danh bằng sinh học phân tử dưới sự trợ giúp của Tin sinh học đang được sử dụng rộng rãi vì có độ tin cậy cao.Các phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử1) Chuẩn bị nuôi cấy đơn bào tử cho mỗi dòng được xác định.Bước này là rất quan trọng vì một số Trichoderma spp. có thể chiếm một niche sinh thái. Hơn nữa, nó cũng được biết đến do hình thái học thường không thể phân biệt các loài Trichoderma.2) Ly trích DNA từ các mẫu nuôi cấy trmới tốt nhất là trước khi hình thành bào tử bắt đầu để kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose. Nếu có thể, đo nồng độ DNA3) Nhân gene bằng PCR và giải trình tự của gene sau đó so sánh với ngân hàng gene có sẵn.Có 3 kiểu giải trình tự thường gặp như sau:TrichoKeyGen được tách từ sợi nấm 2-4 ngày tuổi, DNA đã được phân lập bằng cách sử dụng Các Kit chuẩn. khuếch đại rDNA nhân, có chứa các ITS1 và 2 và gen rRNA 5.8S theo phương pháp của Kullnig-Gradinger et al.,2002. mảnh 0,3 kb của tef1, chứa intron lớn sử dụng cặp mồi EF1-728F (5 -CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3) và EF1-986R(5-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3) ​để khuếch đại.​Tinh sạch và giải trình tự theo phương pháp của Kullnig-Gradinger et al.,2002. Tất cả các chuỗi thu được trong nghiên cứu này đã được đưa lên NCBI GenBank hoặc đưa lên so sánh bằng TrichoKey trên website www.isth.infoTrichoMARK và TrichoBLASTPhương pháp áp dụng tương tự trên TrichoKey nhưng gen được khuếch đại bằng cặp mồi EF1728F (9) và TEF1LLErev (5’-AAC TTG CAG GCA ATG TGG-3’)Trình tự gene sau khi giải được đưa vào TrichoMark và TrichoBlast để đọc và so sánh với ngân hàng gene có sẵn.Phân tích phát sinh loài đa locus với trình tự của các loài liên quan nhất.Phương pháp này sử dụng trình tự các gene rpb2 RNA polymerase, tef1, cal1 calmoduline chi18-5 endochitinase 18 - 5 (former ech42) để xác định loài. Phương pháp tiến hành tương tự phương pháp với TrichoBlast. Phương pháp này chỉ áp dụng khi tìm kiếm các loài mới cho khoa học.Các phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tửXét nghiệm đa dạng sinh học quy mô lớn với một số lượng lớn các chủng Trichoderma phân lập từ một số địa điểm với độ dốc nhất định của điều kiện;Xác định chủng đơn lẻKiểm soát đối với các loài đặc chủng được phân lập công nghiệpSàng lọc đối với một số loài Hypocrea / Trichoderma phân biệt bởi ITS1 và 2ITS1 và 2 internal transcribed spacers 1 và 2 ( đệm sao chép nội bộ ) của cụm gene rRNAphương tiện đánh dấu mã vạch chủng nấmTrichOKEYChương trình mã vạch DNA oligonucleotideƯu điểm: cho kết quả xác định tuyệt đối    ghi nhận những chuỗi nhiều định dạng trong FASTA xác định 95% loài được biết đến Hypocrea / Trichoderma dễ dàng khuếch đại PCR ITS1 và 2    phân biệt các loài tiềm năng mới hoặc allelsNhược điểm:    phụ thuộc vào chất lượng trình tự và compleatness (ITS1 - 5.8S rRNA - ITS2) không phân biệt các loài trong khu phức hợp Koningii và Rufa và không phân biệt cặp loài T. longibrachiatum - H. orientalis và T. tomentosum - T. cerinum Xác định chủng được xác định bởi TrichOKEYXác định các loài Trichoderma tef1translation elongation factor 1-alpha encoding gene( gen mã hóa yếu tố dịch kéo dài 1-alpha ) công cụ tìm kiếm Trình tự tương tự TrichoMARK và TrichoBLAST TrichoMARK được khuyến khích như một công cụ quan trọng để chẩn đoán chuỗi trước khi BLAST. Chương trình lấy các mảnh vỡ chẩn đoán nhất cho việc tìm kiếm tương tự sau những gì đáng kể làm tăng tính chính xác của việc tìm kiếm tương tự như ở BLAST TrichoBLAST hoặc NCBITrichoBLAST một công cụ liên kết multiloci cục bộ dựa trên cơ sở dữ liệu xác nhận của chuỗi Hypocrea / TrichodermaNó bao gồm ba locus phát sinh loài trong các gen tef1, ITS1-2 và rpb2Phát hiện các loài mớirpb2RNA polymerasetef1cal1calmodulinechi18-5endochitinase 18 - 5 (former ech42)Phân tích phát sinh loài đa locus với trình tự của các loài liên quan nhất.Phát hiện loài lân cận bằng cách sử dụng TrichoBLAST (Lưu ý: chưa bao gồm cal1 và chi18-5 )Lấy chuỗi trình tự tương ứng bằng cách sử dụng Cơ sở dữ liệu chỉ thị phát sinh loài đa locus ISTH Cơ sở dữ liệu này chứa các trình tự duy nhất được xác minh của tất cả các loài phân tử đặc trưng của Hypocrea / Trichoderma. Cơ sở dữ liệu có thể được tìm kiếm bởi các loài hoặc tên locus, trình tự có thể được lấy ra trong các định dạng FASTA nhiều thích hợp cho sự liên kết tiếp theo và phân tích phát sinh loàiCác phương pháp định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử dưới sự trợ giúp của Sinh tin họcChitinaseChitinase là một trong những protein quan trọng nhất liên quan đến bệnh học, nó được cây trồng sử dụng để chống lại các loại nấm bệnh.Các loại nấm đối kháng như Trichoderma có khả năng tiết enzyme chitinase để phân hủy các loại nấm gây hại đối với cây trồng. Các chủng Trichoderma có khả năng tiết chitinase mạnh thường có khả năng đối kháng mạnh với các loại nấm gây bênh cho cây trồng như Rhizoctonia, Fusarium.Để xác định enzyme chitinase người ta sử dụng gen endochitinase.Khuếch đại PCR và phân tích RFLP của gen endochitinase 42-kDa.PCRs được thực hiện với các oligonucleotides với cặp mồi 5’-CACTTCACCATGTTGGGCTTCCTC và 5’-GATCTCTAGTTGAGACCGCTTCGG.Sau khi giải trình tự. Mẫu gen được so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI để xác định chính xác các dòng có enzyme chitinase. So sánh trong ngân hàng để chọn mẫu gene enzyme chitinase tốt nhất.Ngoài ra cặp mồi 5'-AA(AJG)CA(A/G)AATAT(A/C/T)GCIGTITATTGGGG-3' (amino, sense) and 5'-TTGACACCAGACCAACTGGTAATGG-3' (M13 reverse primer, antisense). Cũng được sử dụng để xác định và khuếch đại gen enzyme chitinase Gene endochitinase 42 của Trichoderma harzianumCGTTGCTGTCGRGCTTGAACARTCTRCCAACRTCRCRAGCARTTCRCCRTGTTGAGCTTC 60M L S F-34CTCGGRARATCCGTAGCCTTGCTGGCTGCGCTGCRGGCTACTCTCRGCTCTCCGRRGCCT 120L G K 8 U R L L R R L Q R T L S 8 P K P-30 -20GGCCRCRGRRGAGCGTCTGTTGRGRRGAGRGCCRRCGGRTRCGCAARCTCCGTCTATTTC 180G H R R A 8 U E K R IA II G Y R It 8 U Y F I-10 +1 loRCCRACTGGGGCRTCTRCGRCCGCRRCTTCCAGCCTGCCGRTTTOGTGOCRTCRGATGTC 240IT FI 14 8 I Y D R I N F Q P R O L U R 8 D U20 30RCTCATGTCRTCTRCTCCTTCRTGRRCCTCCAOGCAGACGGCRCRGTTRTCTCTGGCGRT 300T H U I Y S F I1 N L 0 R D 0 T U I S G D40 50ACCTRCGCTGRTTACGRGRAGCRCTRTGCCGRTGRTTCTTGGAATGATGTCGGCRCCART 360T V R D Y E K H IY A D D S g N D U G T f4 160 70GCCTACGGCTGTGTCAAGCRGCTGTTCAAGGTCRRGARGGCCRRCOGAGGCOTCRAGGTT 420i'A-'-Y---G--Ic U K Q L F K V K K R N R 8 L K U80 goCTGCTCTCCATCGGTGGCTGGACTTGGTCCRCCRACTTCCCTTCTGCRGCAAGCRCGGRT 480L L S I G G 14 T 14 S T N F P 8 A R S T D100 110GCCAACCORRRGRACTTTGCGAAAACTGCCATTRCCTTTRTGAAGGRTTGGGGTTTCGAT 540R It R K N F R K T R I T F M K D N G F D120 130GGTRTTGRTRTCGRCTGGGRGTRCCCTGCAGACGCCACCCAGGCCTCCRRCRTGRTTCTT 6008 I D I 0 14 E Y P R O A T O R S N M 1 L140 150CTGCTORAGGAAGTCCGRTCTCAGCOTGRTGCTTRTGCTGCCCAGTRTGCCCCTGGCTAC 660L L K E U R S O R O R Y R R Q Y R P G Y160 170CACTTCCTCCTCRCCATTGCCGCCCCRGCTGGCRRGGRCAACTACTCCRRGCTGCGCCTG '720H F L L T I A A P R 0 K 0 It Y 8 K L R L180 1goGCTGRTCTTGGCCRAGTCCTCGRCTACRTCRACCTCATGGCCTRCGRCTACGCCGGRTCC '780A O L G Q U L O Y I It L M R Y O Y R G S200 210TTCAGCCCCCTCRCCGGTCRCGRCGCCRRCCTGTTTAACRRCCCGTCCRACCCCARTGCC 840F S P L T G H D R II L F tt N P S N P N R220 230ACCCCCTTCARCRCCGRTTCCGCTGTCAAGGRTTRTATCARTGGAGGTGTTCCCGCCRAC go0T P F N T 0 S A U K D V t N G G U P A N240 250AAGATTGTTCTCGGCRTGCCCRTCTACGGARGATCRTTCCAGAACACCGCTGGTATTGGC go0K I U L G M P I Y G R S F Q FI T R 3 I G260 270CRGACTTRCRRTGGTGTTGGRAGTGGRRGCTGGGRGGCCGGTRTCTGGGRTTRCRAGGCT 1020Q T Y It G U G S 8 8 14 E R G I 14 O Y K A280 290CTTCCCRAGGCTGGCGCCRCCGTCCRGTRCGRTTCTGTCGCRRAGGGCTACTRCAOCTAC 1080L P g A G R ~r U Q Y D S U A K G Y Y S Y300 310AACTCCGCCRCCRRGGAGCTCRTCTCTTTCGRTRCCCCCGACRTGRTCRACACCRAOGTT 1140N 8 R T K E L I S F D T P D I1 I It T K U320 330GCCTRTCTCRRGTCTCTCGGCCTGGGRGGTRGCATGTTCTGGGRGGCCTCRGCCGRCARG 1200R Y L K 3 L IG L G G S M F 14 E R 8 R O K I340 350RRGGGRGCTGRCTCTGTGRTTGGRRCRRGCCRCRGAGCTCTTGGRGGCCTGGACACAACT 1260FK'--]8 R D S V I 0 T 3 H R ~ L G G L D T T I860 3'70CAAAACCTGCTGRGCTRCCCCAACTCCAAGTRTGATRACATCAAGARTGGTCTGRACTAG 132(3IQ I,I L L 8 Y P N S K I v O rl I K H G L N380GCTGCCTGTTTTGRGGCGCCTTATGGRCRTTGAAGTCGTCGCOGGGRARTOGTCTTGGA8 1380GAGCRGGGTCRTGAAGTRRATRTTTGTTTAAATRCCTGTRCRTRGCCRCRTTAGCATATR 14408RTGCRTGARTAGTRTCTGAGTTTATTRTARAARARAARARARAAAARARAAAAAAA 14Ứng dụngChuyển gen tạo enzym chitinase vào thực vật để cây trồng có khả năng đối kháng lại các loại nấm bệnhCác nhà khoa học tại Viện nghiên cứu trồng trọt Ấn độ đã nghiên cứu chuyển gen Chit42 thành công vào cây thuốc lá để ngừa các loại nấm gây bệnh cây trồng.Ứng dụng