Đồ án Công nghệ 1 “Sự phân bố, thu nhận và ứng dụng enzyme Protease”

hả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng. 
	Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate...
PEG
PPB
w
w
w
w
w
w
w
Trộn đều
Sau khi phân tách
w
 tạp chất 
PEG: polyethylene glycol
PPB: potassium phosphate buffer
Protease và tạp chất
w
w
w
w
Hình 3.9. Phương pháp tách hệ hai pha nước
3.2. Thu nhận enzyme từ hạt cốc nảy mầm.
 	Malt là loại hạt hoà thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt.
 	Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau:
— Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại và bảo quản hạt.
— Rửa, sát trùng và ngâm hạt.
— Ươm mầm ta sẽ thu được malt tươi.
— Sấy malt tươi.
— Xử lý và bảo quản malt khô.
 	Hoạt tính proteaza trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4÷8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tinh amylaza và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5. Sự thuỷ phân protein bắt đầu bằng tác dụng của proteinaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các axit amin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt.
 	Tuy nhiên, vì nhiệt độ nẩy mầm tương đối thấp và thời gian nảy mầm tương đối dài sẽ có sự thuỷ phân protein tương đối sâu sắc để tạo thành một lượng đáng kể các polypeptit và axitamin. Tác động này chỉ diễn ra với nội nhũ, trong khi protein ở lớp ngăn cách nội nhũ với vỏ và cả phần vỏ malt thì không bị biến đổi cả trong cả quá trình chế biến về sau.
3.3. 	Thu nhận enzyme protease từ thực vật
3.3.1. Họ dứa (Bromalaceae)	
 Bao gồm tất cả các nòi dứa trồng lấy quả, lấy sợi (kể cả các nòi dứa dại).
 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguyên liệu lấy khô ở nhiệt độ 4000C sẽ giữ được hoạt tính enzyme tốt hơn so với nguyên liệu đã được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C.
Nguyên tắc chung để thu nhận Bromelain.
Phế liệu dứa à làm dập à chiết lọc à ly tâm à kết tủa à ly tâm à lọc à chế phẩm kỹ thuật à sắc ký trao đổi ion à sấy thăng hoa à sản phẩm tinh khiết.
Thu nhận Bromelain bằng phương pháp nhanh sử dụng CMC
CMC được tẩm ướt bằng dung dịch đệm photphat 0,05M, pH= 6,1. Cho dịch chồi dứa vào, thỉnh thoảng khuấy trộn. Enzyme này lên bề mặt của CMC. Sau 2 giờ lấy ra vắt nước loại bỏ cặn bẩn bám vào CMC, rữa trôi các protein không phải enzyme bằng đệm photphat ở pH= 6,5. Sau đó cho phần hấp thụ lần 1. Dung dịch phần hấp thụ là đệm photphat pH= 7,1, NaCl 0,5 N khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt được dung dịch đậm đặc chứa Bromelain. Tiếp tục phần hấp thụ như lần thứ 2 rồi gộp chung dịch chiết của cả hai lần kết tủa enzyme bằng axeton hay còn lạnh.
Ứng dụng 
 Thủy phân gan bò
 Làm đông sữa
 	Sử dụng Bromelain để thu nhận các chất ức chế proteaza.
3.3.2. 	Nhựa đu đủ (Carica Papaya. L)
 Đây là loại cây ăn quả phổ biến ở các nước nhiệt đới. Từ quả tươi hoặc thân thu được nhựa (latex) chính là chế phẩm papain thô để từ đó tinh chế thành papain thương phẩm. Hiện nay người ta đã tạo ra được các giống đu đủ có sản lượng mủ và hoạt tính papain cao để khai thác có hiệu quả nguồn enzyme này. Papain có M= 20.700, Top= 800C, pHop= 5÷ 5,5. Bị ức chế và mất hoạt tính bởi H2O2, Iodoaxetat, I2, fericianua. Được hoạt hoá bởi –CN, cystein, H2S và glutation.
Thu nhận papain thô: Dùng các loại quả đu đủ còn non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau sạch vỏ, lấy dao cạo sạch nhũng đường không quá sâu, hứng nhựa vào cốc rồi làm khô. Kết quả cho thấy hoạt tính papain sau khi chiết tách cao hơn khi đã để 3 tháng.
Thu nhận papain thương phẩm: Ngâm papain thô hòa tan nhựa tươi (catex) trong nước cất có bổ sung glyxerin để tăng độ hòa tan, lọc qua vải màn. Kết tủa bằng axeton lạnh với tỷ lệ 2:1 so với thể tích dịch lọc. Ly tâm lạnh lấy kết tủa, sấy 45- 500C, đem nghiền thành bột.
Ứng dụng: làm đông sữa, thuỷ phân protein như sản xuất bột cá thực phẩm, sản xuất nước mắm ngắn ngày, làm mềm thịt.
Chương 4:
 ỨNG DỤNG ENZYM PROTEASE
 	Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp
 	Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ). Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
 	Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
	Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus, được dùng trong sản xuất pho mát. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
 	Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
	Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng.
 	Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được được bóng, dể nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
 	Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,
Hình 4.1. Sản xuất thuốc
	- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,
Hình 4.2. Sản xuất xà phòng
KẾT LUẬN
 Trong quá trình thực hiện Đồ án Công nghệ 1: “Sự phân bố, thu nhận và ứng dụng enzyme Protease” tôi đã đạt được các kết quả sau:
	- Hiểu ý nghĩa,vai trò của enzyme Protease trong sản xuất và đời sống xã hội, đặc biệt trong tương lai khi công nghệ sinh học phát triển.
 - Biết sự phân bố và nắm được một số phương pháp thu nhận enzyme.
 - Biết được một số nhóm vi sinh vật chính có thể sản xuất enzyme Protease.
 - Nắm được một vài đặc điểm sinh lý của vi sinh vật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.
Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Lưu Thị Nguyệt Minh(2007), “Phân tách Protease của Bacillus Subtilis bằng hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp.
Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội.
TÀI LIỆU MẠNG
1. 
2. 
 3.
4.
5.