Giáo trình Di truyền y học - Chương 4: Một số phương pháp phát hiện các biến dị di truyền ở mức phân tử

p ở nhiệt độ 
này dưới sự xúc tác của DNA polymerase bắt đầu từ đoạn primer. Các 
DNA mới được tổng hợp sẽ có cấu trúc xoắn kép với đầu 5' mang primer 
được kéo dài bởi các nucleotide theo nguyên tắc bổ sung dưới sự xúc tác 
của enzyme DNA polymerase. 
Chuỗi xoắn kép DNA này lại được đun nóng ở nhiệt độ cao trở lại 
để tách xoắn. Chu kỳ nóng lạnh này được lập đi lập lại nhiều lần cho phép 
các DNA mới được tổng hợp đóng vai trò như các khuôn mới để tổng hợp 
thêm các DNA mới và số lượng của các bản sao tăng lên theo lũy thừa của 
2. Khi chu kỳ này được lập đi lập lại từ 20 đến 30 lần sẽ tạo ra hàng triệu 
bản sao của DNA ban đầu. 
Tóm lại PCR là một quá trình bao gồm ba bước cơ bản: 
(1) Tách cấu trúc kép DNA bằng nhiệt độ cao 
(2) Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp 
(2) Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian. Kết quả là tạo ra các 
đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về trình tự . 
Mỗi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 DNA ban 
đầu có thể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ. 
 9 
 Do tính đơn giản của kỹ thuật nên các máy PCR đã được chế tạo để thực 
hiện công việc này một cách tự động. Khi DNA được khuếch đại, chúng 
sẽ được phân tích theo những hướng khác nhau. Kỹ thuật PCR có nhiều 
thuận lợi hơn các kỹ thuật cổ điển do: 
(1) Có thể được sử dụng với một lượng DNA ban đầu hết sức nhỏ 
với đơn vị tính là nanogram (10- 9g) hoặc picogram (10-12g), số lượng 
DNA này có thể thu được từ các vết máu khô đã nhiều năm, trên một sợi 
tóc hoặc thậm chí từ mặt sau của một con tem được dán bằng nước bọt là 
đủ cho việc phân tích. 
(2) Không đòi hỏi quá trình dòng hóa (cloning), do đó PCR cho kết 
quả nhanh hơn so với các kỹ thuật cũ. 
(3) PCR cho phép tạo ra một lượng lớn DNA tinh khiết nên không 
cần phải sử dụng các probe có hoạt tính phóng xạ để phát hiện các đoạn 
DNA mang đột biến mà dùng các probe không có hoạt tính phóng xạ đánh 
dấu bằng phương pháp hóa học an toàn hơn. 
Tuy nhiên PCR cũng có những bất lợi nhất định: 
(1) Việc tổng hợp các primer đòi hỏi phải có sự hiểu biết về trình tự 
của đoạn DNA nằm cạnh đoạn DNA cần khảo sát. Khi không có những 
thông tin về trình tự của đoạn đó bắt buộc phải sử dụng các kỹ thuật khác. 
(2) Do kỹ thuật PCR hết sức nhạy nên rất dễ bị nhiễm DNA từ các 
nguồn khác trong phòng thí nghiệm. 
(3) PCR rất khó áp dụng với các đoạn DNA dài hơn 1 đến vài kb 
nên kỹ thuật này không thể được sử dụng để phát hiện các đột biến mất 
đoạn gene lớn hơn đoạn DNA trên. Trong trường hợp này phải sử dụng kỹ 
thuật Southern blotting để thay thế. 
Do những ưu việt của kỹ thuật PCR, nên hiện nay PCR được sử 
dụng phổ biến trong chẩn đoán các bệnh di truyền, trong pháp y và trong 
di truyền học tiến hóa. PCR đã thay thế cho kỹ thuật Southern blotting 
trong nhiều lãnh vực và hiện nay thường được dùng để phân tích các 
RFLP và VNTR. 
4. Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) 
Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định 
cho được trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc 
xác định trình tự của DNA cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, 
chức năng của gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết. 
 10 
Hình 8: Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của DNA bằng cách sử dụng 
phương pháp dideoxy 
Một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của DNA là 
phương pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đưa ra. 
Phương pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng các dide-
oxynucleotide chấm dứt chuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide). Đây 
là các nucleotide có cấu trúc tương tự như các deoxyribonucleotide bình 
thường khác chỉ khác ở chỗ chúng thiếu mất một nhóm hydroxyl trong cấu 
trúc. Sự khác biệt này trong cấu trúc làm cho phân tử này không thể tạo 
 11 
 thêm liên kết phosphodiester với các nucleotide tự do. Như vậy mặc dù 
các dideoxynucleotide có thể gắn vào một chuỗi DNA đang được tổng hợp 
nhưng sau nó không có thêm nucleotide nào gắn vào thêm được nữa và 
chấm dứt quá trình nhân đôi ngay tại vị trí đó. Người ta sử dụng 4 loại 
dideoxynucleotide khác nhau, mỗi loại sẽ bổ sung với các 
deoxyribonucleotide A, T, G, hoặc C. 
Trình tự của một chuỗi đơn DNA nào cần đọc trình tự sẽ đựơc trộn 
với các primer được đánh dấu bằng các chất hoạt tính phóng xạ, DNA 
polymerase, các nucleotide thông thường và một loại dideoxynucleotide. 
Primer sẽ lai với một vị trí tương ứng trên chuỗi đơn DNA theo nguyên 
tắc bổ sung và DNA polymerase sẽ giúp bổ sung tiếp các nucleotide như 
trong kỹ thuật PCR. Dideoxynucleotide sẽ gắn vào chuỗi DNA đang được 
tổng hợp khi có nucleotide tương ứng theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên 
khi điều này xảy ra thì quá trình tổng hợp chuỗi DNA cũng bị ngừng lại. 
Ở bất kỳ một vị trí nhất định nào, hoặc sẽ có một nucleotide bình 
thường hoặc một dideoxynucleotide có thể được thêm vào một cách ngẫu 
nhiên. Quá trình này cho phép cho phép tạo nên các đoạn DNA với chiều 
dài khác nhau, mỗi đoạn đều kết thúc bời cùng một loại 
dideoxynucleotide. Những đoạn DNA có thể phân lập theo chiều dài bằng 
điện di như trình bày ở phần trên. 
Bốn loại phản ứng khác nhau được thực hiện cho 4 loại nucleotide, 
các đoạn thu được từ mỗi loại phản ứng sẽ được chạy điện di bên cạnh 
nhau trên cùng một gel để vị trí của các đoạn có thể so sánh được với 
nhau. Vì mỗi band ứng với một chuỗi DNA tận cùng bởi 1 loại base duy 
nhất nên trình tự của DNA có thể được đọc bằng cách quan sát thự tự của 
các band trên gel sau khi sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự chụp (các primer 
có hoạt tính phóng xạ sẽ chỉ vị trí của các đoạn DNA trên phim). Trong 
mỗi quá trình phản ứng như vậy có thể đọc được trình tự của vài trăm cặp 
base.(hình 8) 
Tuy nhiên cách đọc trình tự của DNA theo cách này tương đối 
chậm, khó khăn và dễ sai sót. Gần đây kỹ thuật đọc trình tự DNA tự động 
(automated DNA sequenced) sử dụng hệ thống phát hiện màu huỳnh 
quang (fluorescent), hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống 
đo màu (colorimetric) đang được phát triển. Việc sử dụng các primer hoặc 
dideoxynucleotide được gắn huỳnh quang giúp cho phương pháp này trở 
nên phổ biến. 
Một mạch khuôn DNA được đọc trình tự bằng cách sử dụng phương 
pháp tương tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR. Mỗi một trong 4 
dideoxynucleotide khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quang cho 
 12 
 phép phát ra một phổ ánh sáng riêng. Các đoạn DNA đã được gắn huỳnh 
quang sau phản ứng tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide rất 
mỏng rồi sau đó được kích thích bằng một chùm tia laser . Ánh sáng phát 
ra được ghi nhận qua một camera kỹ thuật số (digital camera) để chuyển 
thành các tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh. Ảnh này được phân tích để 
chuyển thành dạng đồ thị trong đó mỗi một loại nucleotide khác nhau 
được mô tả bằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này 
trên đồ thị cho phép đọc trình tự của đoạn DNA. Một đoạn khoảng 500 bp 
của 64 người khác nhau có thể được phân tích trên cùng một gel trong 
vòng từ 2 đến 4 giờ. 
Phương pháp đọc trình tự tự động cũng được thực hiện cho việc 
đánh giá tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình của 
đơn nucleotide (single-nucleotide polymorphism: SNP) và các dạng đa 
hình khác. 
Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu DNA được điện di 
trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary) 
chứ không phải trên gel polyacrylamide. Vì những ống này rất mỏng và 
lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra 
rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ 
trong vòng 15 phút. 
Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ (mass 
spectroscopy), đây là một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để 
phân tích protein. Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted 
laser desorption/ionization time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm 
mẫu DNA trong vài phút. Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự quan 
tâm trong việc sử dụng để đọc trình tự DNA. 
Bằng cách sử dụng vi tính và các kỹ thuật tự động đã làm tăng khả 
năng đọc trình tự của DNA và đã cho phép đọc được trình tự của toàn bộ 3 
tỷ bp trong genome của người. 
5. Chip DNA (DNA chip) 
Chip DNA hoặc DNA microarray là một kỹ thuật mới để phát hiện 
các đột biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân 
tích đột biến bằng vi tính. 
Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide đóng vai trò của các 
đoạn dò (probe) được máy cài lên một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính 
như vậy với diện tích khoảng 1cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng 
ngàn loại oligonucleotide khác nhau. Các oligonucleotide này gồm các 
DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình tự mang các đột biến 
 13 
 gây bệnh đã biết. DNA của một đối tượng nào đó được gắn huỳnh quang 
và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác định xem chúng 
lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến. Mẫu lai được phân tích 
trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang 
loại đột biến cụ thể nào (hình 9). 
Hình 9: Sơ đồ minh hoạ một chip DNA. 
Các oligonucleotide được đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA được gắn 
huỳnh quang của một đối tượng. Quá trình lai xảy ra nếu có một oligonucleotide có trình 
tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA của đối tượng. Ví trí phát huỳnh quang trên chip 
sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên chip 
Một ứng dụng khác của chip DNA là là xác định xem gene có biểu 
hiện (nghĩa là được phiên mã) ở trong một mẫu mô nào đó không (ví dụ 
như từ một khối u). Người ta chiết mRNA từ mô rồi dùng nó làm bản 
khuôn để tạo thành các đoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung. Sau đó đoạn 
này được đem lai trên phiến kính với các oligonucleotide đại diện cho 
nhiều loại gene khác nhau. Tín hiệu lai dương tính ở tại vị trí nào đó trên 
phiến kính chứng tỏ gene đó được biểu hiện trên mẫu mô. 
 14