Giáo trình Vi sinh vật học - Phần 3

tan vào môi trường thạch-nước thịt-pepton vừa khử trùng, để nguội đến 50-55 0C rồi đổ đĩa Petri.
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm trên đĩa thạch, mỗi điểm đường kính khoảng 2-3mm. Cấy 5-7 chủng trên một đĩa. Với vi khuẩn kỵ khí có thể đậy lá kính mỏng (lamelle) lên vết cấy, tuy nhiên tốt nhất là đưa vào tủ nuôi kỵ khí. 
·        Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 18-24 giờ, một số chủng (như chi Bacillus) cần thời gian lâu hơn (48 giờ) và quan sát biến đổi của môi trường thạch.
·        Nếu xung quang và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (Lecithin được chuyển hoá thành lipid do vi khuẩn sinh men lecithinaza).
·        Chú ý: khi trộn dịch huyền phù lòng đỏ trứng vào môi trường thạch không nên tiến hành ở nhiệt độ quá cao vì sẽ làm ngưng kết lecithin có trong lòng đỏ trứng.
Hình 3.10.       Khả năng phân hủy Lecithin của Clostridium
3.33. Khả năng sản sinh H2S
Phương pháp giải giấy
·        Môi trường: 
Pepton                                                              10 g
NaCl                                                                  5 g
Cao thịt                                                             10 g
Cystein                                                              0,5 g
Nước cất                                                           1000 ml
pH = 7,0-7,4
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút. 
·        Cắt giấy lọc thành dải rộng 0,5-1cm, độ dài tùy thuộc vào ống nghiệm và độ cao của môi trường. Tẩm vào giấy dung dịch Chì-acetat, sấy khô giấy trong tủ sấy đặt trong hộp Petri và khử trùng.
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ). Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì-acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài đến nút bông nhưng không chạm vào môi trường. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày thì lấy ra quan sát. Nếu giấy biến đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu thì là âm tính.
·        Chú ý: phương pháp này rất mẫn cảm, không thích hợp đối với trực khuẩn đường ruột. Không đặt giấy lọc tẩm chì-acetat gần mặt môi trường quá để tránh bị hút ẩm, nhưng cũng không nên đặt cách xa quá. Ngoài ống đối chứng không cấy vi khuẩn nên lấy chủng vi khuẩn đã biết là âm tính để làm đối chứng.
Phương pháp đối với Trực khuẩn đường ruột
·        Môi trường: 
Cao thịt                                7,5 g
Pepton                                  10 g
NaCl                                     5 g
Gelatin                                  100-120 g (hay thạch      15 g)
Dung dịch FeCl2 10%              5 ml (khử trùng riêng bằng màng lọc)
Nước cất                                 1000 ml
pH = 7,0
Khử trùng ở 112 0C trong 20 phút, bổ sung dung dịch FeCl2 (đã khử trùng)  vào khi thạch hay gelatin chưa đông. Phân vào các ống nghiệm vô khuẩn (4-5 ml), ngay lập tức nhúng vào nước lạnh cho đông lại.
·        Cấy chích sâu vi khuẩn vào các ống, nuôi ở 30 0C trong 1,3,7 ngày. Nếu môi trường chuyển thành màu đen là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu là âm tính.
·        Chú ý: phương pháp này dùng khi cần định tên vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Có thể dùng FeSO4 thay thế cho FeCl2. Nếu nuôi cấy ở 20 0C có thể dùng kết hợp để xác định gelatinaza.
3.34. Khả năng phân giải sữa (Litmus Milk Reaction)
·        Môi trường: sữa tươi đun sôi, để lạnh qua đêm, ly tâm và hớt bỏ bơ ở lớp trên, phần dưới là sữa không chứa lipid. Có thể dùng sữa bột đã loại chất béo (hoà tan 100 g sữa bột với 1000 ml nước). 
·        Thuốc thử Litmus: 
hoà tan 2,5 g Litmus trong 100 ml nước cất, lọc bằng giấy lọc, để qua đêm mới sử dụng. Có thể bảo quản lâu.
·        Môi trường sữa –Litmus: 
Dung dịch Litmus 2,5%                  4 ml
              Sữa đã loại bơ                           1000 ml
    Môi trường có màu đỏ tía.
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 ml), khử trùng gián đoạn hay khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút. 
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi ở nhiệt độ thích hợp, sau 1,3,5,7,14 ngày lấy ra quan sát.
·        Dựa vào biến đổi của môi trường mà có những kết luận như sau:
Môi trường chuyển thành màu trắng ® phản ứng khử Litmus 
Môi trường trở nên trong ® phản ứng peptôn hoá
Môi trường chuyển mầu đỏ ® phản ứng sinh acid
Môi trường chuyển màu xanh lam ® phản ứng sinh kiềm
Môi trường chuyển màu đỏ, sữa ngưng kết ® sinh acid và ngưng kết
Ngưng kết do men: không chuyển màu hoặc có màu lam, sữa vón cục và ngưng kết
·        Chú ý: tốt nhất nên dùng sữa tươi, không cần điều chỉnh pH.
3.35.           Khả năng oxy hóa Gluconat
·        Đệm Kali phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2:
                                      A) KH2PO4                                       9,078 g/L
B) K2HPO4.12H2O                            23,876g/L
Trộn 3 ml dung dịch A với 7 ml dung dịch B để có dung dịch đệm phosphat  1/15 mol/L, pH 7,2
·        Thuốc thử Feling:
Dung dịch A:     CuSO4 tinh thể                       34,64 g
Nước cất                                thêm tới 500 ml
Dung dịch B:     Na-Tartrat                             173 g
KOH                                      125 g
Nước cất                                thêm tới 500 ml
Trước khi dùng trộn hai dung dịch A và B theo tỷ lệ 1:1 (vol/vol), sử dụng trong ngày.
·        Chuẩn bị dung dịch gluconat 1% trong đệm phosphat pH 7,2, phân vào các ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Khử trùng 112 0C trong 30 phút. 
·        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) để tạo dịch huyền phù đậm đặc trong đệm phosphat, giữ ở 30 0C qua đêm. 
·        Thêm vào mỗi ống 0,5 ml thuốc thử Feling, đặt trong bình cách thủy sôi 10 phút.
·        Kết quả: nếu dịch huyền phù chuyển từ màu lam sang màu vàng lục, lục da cam hoặc có kết tủa đỏ là phản ứng dương tính; nếu không đổi màu là âm tính.
·        Chú ý: nếu dùng gluconat canxi thì dễ tạo kết tủa với gốc phosphat, tuy nhiên không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
3.36.           Khả năng oxy hóa Etanol
·        Với vi khuẩn Acetobacter dùng môi trường sau: 
Cao men                                             10 g
Nước máy                                           1000 ml
Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%            20 ml. 
 pH = 6,8-7,0
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 121 0C trong 20 phút. Lúc sử dụng thêm ethanol vào mỗi ống ở nồng độ khoảng 2-10% (vol/vol)
·        Với các vi khuẩn khác: dùng môi trường như trong thí nghiệm oxy hóa/lên men, thay đường bằng etanol với nồng độ 1%. Có thể không cần thạch.
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, nuôi 1,3,7,14 ngày trong điều kiện thích hợp
·        Kết quả: nếu môi trường chuyển màu vàng (do sinh acid) thì là dương tính, không đổi màu là âm tính.
Phương pháp khác (dùng để phân lập và kiểm định Acetobacter): 
·        Thêm vào các môi trường nói trên 2% thạch và 1% CaCO3; nồng độ etanol cuối cùng là 2%; không thêm chỉ thị màu. Đổ thạch đĩa. 
·        Cấy vi khuẩn trên thạch đĩa, nuôi 3, 7, 14 ngày ở điều kiện thích hợp.
·        Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải trong là kết quả dương tính, nếu không là âm tính (Acetobacter lúc đầu phân giải CaCO3 nên tạo vòng trong, nhưng sau đó acetat canxi tạo ra bị oxy hóa tiếp chuyển thành CaCO3 vòng trong chuyển màu trắng sữa sáng do acid acetic đã bị oxy hóa).
3.37. Khả năng oxy hóa acid acetic
·        Môi trường: 
Cao men                                                 10 g
Ca-Acetat                                                10 g
Thạch                                                      20 g
Nước máy                                               1000 ml
pH 7,0-7,2
Phân môi trường vào bình tam giác hoặc các ống nghiệm lớn để khử trùng, đổ thạch đĩa hoặc làm ống thạch nghiêng.
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi 3-5 ngày ở điều kiện thích hợp
·        Kết quả: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat đã bị oxy hóa, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không thì là âm tính.
3.38.           Xác định Indol-Pyruvic acid (IPA)
·        Môi trường SIM: 
Cao thịt                                                 3 g
Pepton                                                   30 g
Na2S2O3.5H2O                                        0,05 g
Cystin hydrochlorid                                  0,2 g
Ammonium-ferric-citrat                             0,5 g
Thạch                                                     4 g
Nước cất                                                1000 ml
Hoà tan các thành phần môi trường trong nồi cách thủy, chỉnh pH đến 7,4, phân vào các ống nghiệm nhỏ, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút, đặt ống thạch đứng. 
·        Thuốc thử Kovac (có thể mua sẵn hoặc tự pha): 
p-dimethyl aminobenzaldehyd                  8 g
Etanol                                                   760 ml
HCl đặc                                                  160 ml
·        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường SIM, nuôi ở 300C trong 24 giờ.
·        Kết quả: nếu phần trên của môi trường chuyển màu nâu là phản ứng IPA dương tính, nếu không là phản ứng âm tính.
·        Sau đó nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào và quan sát. Nếu trên mặt thạch xuất hiện màu đỏ đào là phản ứng Indol dương tính.
Hình 3.11. Ví dụ minh hoạ phản ứng Indol dương tính.
Tài liệu tham khảo :
1. James G. Cappuccino & Natalie Sherman, 2002.  Microbiology: a Laboratory Manual, 6th ed. Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA.
2. Hans Trueper & Karl-Heinz Schleifer, 2000. Prokaryote Characterization and Identification. In: Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H. & Stackebrandt E. (ed.). The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community. Springer-Verlag, New York.
3. Vũ Thị Minh Đức, 1998. Thực tập Vi sinh vật. NXB GD, ĐHTH Hà Nội.
4. Krieg N.R. & Holt J.G. (ed.) 1984. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA.
5. Đông Tú Châu et al.,2001, Thường kiến tế khuẩn hệ thống giám định thủ sách, Khoa học xuất bản xã (Trung văn).