Sắc ký trao đổi ion

- IEC) The principle of ion-exchange chromatography (salt gradient elution) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) The principle of ion-exchange chromatography	The fractionation of variously charged molecules (squares) on an anion exchanger (cirles) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) IEC illustration	The separation of an amino acid mixture at pH 3.0 on EIC column (above); 	Automatically recorded high-performance liquid chromatographic analysis of amino acids on a cation-exchange resin (below) Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Những nguyên nhân giải thích sự thông dụng của IECCó độ phân giải cao, Khả năng liên kết protein lớn, Đa dạng (các loại nhựa trao đổi khác nhau, nhiều cách kết hợp giữa đệm và pH), Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích), Dễ dàng tiến hành. 	Tuy nhiên, vì protein là những chất cao phân tử, cơ chế tách của chúng thường là phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố: 	Khác biệt trong sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử, 	Các tương tác không tĩnh điện như kỵ nước hay hydro, 	Bản chất các ion đệm  Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực và vào lực ion của môi trường. Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi, Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra. Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào: Sự phân bố điện tích bề mặt của protein. ph. Bản chất các ion trong dung dịch.Các chất được thêm vào như dung môi hữu cơ.Đặc tính của chất trao đổi. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Rõ ràng là điện tích của protein càng cao, nó càng gắn chặt vào chất trao đổi tích điện trái dấu. Tương tự như vậy, chất trao đổi càng tích điện nhiều (có nghĩa là có mức độ thay thế các nhóm tích điện mạnh hơn), sẽ liên kết với protein mạnh hơn các chất tích điện yếu. Những điều kiện khác như pH làm thay đổi hoặc protein hoặc chất trao đổi sẽ ảnh hưởng đến tương tác của chúng và có thể được sử dụng để tác động lên quá trình trao đổi ion. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Nguyên tắc của IEC là phân tách dựa trên sự khác biệt về ionGồm có pha tĩnh (cột nhồi gel, với khác biệt là có các nhóm chức năng ở dạng ion hoá) Pha động. 	Về cách thực hiện IEC gồm hai bước: 	1) gắn protein vào các điện tích cố định trên cột	2) chiết rút chúng ra. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Các chất (nhựa) trao đổi ion và cách lựa chọnNhiều loại nhựa có chứa nhóm tích điện cố định trên chất giá không tan được bán và sử dụng rộng rãi (liệt kê trên bảng với khoảng pH thích hợp). 	Các chất trao đổi có chứa hoặc nhóm acid hoặc base:Chất trao đổi ion base có chứa nhóm tích điện dương và được gọi là anionit (nhựa trao đổi cation, vì chúng gắn và trao đổi cation),Ngược lại, chất trao đổi acid có chứa nhóm tích điện âm là cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi anion) 	(Các nhựa tích điện dương được gọi là "trao đổi anion"; các nhựa tích điện âm là "chất trao đổi cation").	 Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Các nhựa pha rắn thông dụng gồm: cellulose, dextran, agarose, và polystyrene. 	Nhóm trao đổi anion yếu: DEAE (diethylaminoethyl)là 1 base yếu (có điện tích dương rõ khi ion hoá và do vậy sẽ liên kết với các anion trao đổi), pH 2-9; chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng hạt hay sợi 	Nhóm trao đổi cation yếu: CM (carboxymethyl):là 1 axit yếu có điện tích âm rõ khi ion hoá, do vậy liên kết với cation trao đổi; pH 3- 10, chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng sợiProtein là những chất lưỡng tính, có tổng điện tích thay đổi tuỳ thuộc môi trường: Dương ở pH thấp, Âm ở pH cao Zero ở pI .Nhóm tham gia tương tác của protein thường là carboxyl: - COOH  - COO- + H+ 	và amino hoặc amin bậc ba: 	- NH2 + H+  -NH2H+Do vậy một chất trao đổi anion liên kết với protein thông qua nhóm carboxyl không proton hoá và được tách (rời) ra bằng nhóm amin proton hoáĐối với chất trao đổi cation thì ngược lại. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Theo nguyên tắc chung:Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng nhựa trao đổi cation.	Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng đến sự tách. 	Độ mạnh của liên kết liên quan đến cả pI của protein lẫn số điện tích tổng số. 	Do vậy, hai protein có pI bằng nhau không tách được bằng đẳng điện cân bằng lại có thể tách bằng IEC nếu sử dụng giá trị pH mà tại đó chúng có chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử.	 Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Có thể lựa chọn kiểu tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamid trong điều kiện acid và kiềm, những phân tách này sẽ là những kiểu phân tích sắc ký trao đổi cation và anion tương ứng.	Ví dụ nếu tách phân tích tốt một hỗn hợp bằng điện di kiềm thì nó có thể tách tốt bằng chất trao đổi anon ở pH tương tự. Cellulose là loại nhựa được ưa dùng hơn cả để tách protein , Những dẫn xuất của Sephadex G-50 bị thay đổi thể tích rất mạnh khi lực ion thay đổiCác dạng nhựa mới của cellulose, vi hạt và hạt của Whatman có độ lặp lại, khả năng và độ phân giải cao hơn dạng sợi cũ. Dung tích với protein là tương đối giống nhau ở các loại nhựa: (0.11- 0.15 g albumin/ ml của các loại dẫn xuất DEAE Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Schematic morphological structure of different support materials Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Cách chuẩn bị và tái sinh cộtCần rửa, làm trương (một số nhựa được bán ở dạng đã được trương sẵn có thể dùng ngay), và xử lý nhựa thành dạng cần thiết trước khi dùng. Các IEC có thể tái sử dụng nhiều lần, sau mỗi lần sử dụng nhất thiết phải tái sinh (hồi nguyên) nhựa.Rửa và làm trương trộn nhựa với khoảng 10 thể tích đệm, để lắng, gạn bỏ các hạt lơ lửng(để đảm bảo tốc độ chảy ổn định). Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Charged groupsFunctional groups used on ion exchangers Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Sephadex ion exchangers (SIE) (A-25 or A-50 and C-25 or C-50 designating the matrix porosity) 	Xử lý (với Sephadex và Sepharose acid và base chỉ được dùng ở nồng độ 0,1M):Khuấy nhẹ nhựa trong ~ 5V thể tích trương với 0,5 M HCl (anionit) hoặc 0,5 M NaOH (cationit), để 30 phút ở to phòng, thỉnh thoảng khuấy.Rửa sạch bằng nước (bằng phễu lọc hút chân không), hoặc bằng giấy lọc cho đến khi pH đạt hơn 4 (sau acid) hoặc thấp hơn 8 (sau kiềm)Khuấy nhẹ nhựa trong 5V 0,5 M NaOH (anionit) hoặc 0,5 M HCl. Để 30 phút, thỉnh thoảng khuấy.Lặp lại bước 2	Đến đây nhựa đã được loại hết protein còn lẫn, và các ion proton hoặc hydroxyl liên kết yếu với các nhóm tích điện của các cationit hoặc anionit, chúng có thể được thay thế dễ dàng bằng các ion tương đương của đệm được lựa chọn. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Chọn đệm: 	pH cần ở trong khoảng cho phép của nhựa và cần không gây hại đến protein. 	Để protein có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó 	(cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit). 	pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Cân bằng đệm: nhựa cần cân bằng hoàn toàn trong đệm trước khi dùng1. Cho đệm đã xử lý vào 1 lượng tương đương của đệm có nồng độ cao gấp 10 lần đệm thường, trộn và để 30 phút ở to phòng. 2. pH có thể bị thay đổi, khuấy nhẹ nhựa và chỉnh lại pH.3. Để nhựa 30 phút, rửa lại trên phễu với đệm dặc gấp 5 lần.4. Nhồi và rửa cột với đệm thường cho đến khi dịch chảy ra đạt đến pH cần. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Chuẩn bị cột:Thường tỉ lệ giữa đường kính và chiều cao cột từ 1/10 đến 1/20. Lượng nhựa cần dùng được tính từ dung lượng trao đổi của nhựa và lượng mẫu thử rồi thường lấy thừa ra 50%. Nhựa được cho (nhồi) vào cột, ở đáy có bông thuỷ tinh	 Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Cho mẫu và chiết rút:	Mẫu cần thẩm tích kỹ đối đệm chạy trước khi cho lên cột, thể tích không quan trọng (có thể nhiều ít bất kỳ).	Rửa đầu tiên với ít nhất 2 lần (thường là 5 lần hoặc hơn) thể tích cột để loại hết protein không bám. 	Sau đó protein gắn trên cột được đẩy ra bằng cách:tăng lực ion của đệmthay dổi pH của nó (hạ thấp với anionit, tăng lên với cationit) hoặc cả hai biện pháp trên. 	Thường người ta dùng cách đầu vì điều khiển được cẩn thận hơn. 	Lực ion cuốn cùng thường là 1 đối với đa số protein. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) 	Hoặc nồng độ đệm có thể tăng, hoặc được giữ nguyên và tăng các ion khác (như NaCl).	Cách sau hay hơn vì khả năng đệm, do đó pH, được giữ nguyên trong quá trình tách	Nhựa có thể bảo quản ở 40 oC với chất diệt khuẩn (0,03% toluene), với cationit có thể dùng azid. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Resolution in ion exchange chromatography	The result of an ion exchange experiment (as with any other chromatographic separation) is often expressed as the resolution (Rs) between the peaks of interest Determination of the resolution (Rs) between two peaks Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Separation results with different resolutions Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) Hypothetical chromatogramV0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1, VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, Vb1 = peak width for peak 1, Vb2= peak width for peak 2. Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC) The net charge of protein as a function of pH Sắc ký trao đổi ion (Ion- exchange chromatography - IEC)