Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian

Nhóm 10: Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus . 
Thành viên nhóm : 
Phan Thị Phương Thanh : 0615114 
Phan Thị Hồng Thanh : 0615113 
Phan Thanh Hùng : 0515073 
Vũ Đình Kỳ : 0615056 
Lê Duy Lung: 0615239 
Nguyễn Thị Thìn : 0615135 
Nguyễn Đình Phú : 0615288 
Lâm Hồng Tú : 0615343 
 Giáo Viên hướng dẩn : 
Ths.Trần Hoàng Minh Tú 
Cô Bùi Hoàng Bảo Ngọc 
Nội Dung Bài Báo 
Giới thiệu 
Sơ lược về HER-2 và Adenovirus 
Thí nghiệm 
Kết quả thí nghiệm 
Thảo luận 
Mục Đích 
Sử dụng Adenovirus la gián tiếp để đưa gene kháng ung thư buồng trứng 
So sánh liệu pháp dùng Adenovirus với một số liệu pháp khác 
HER-2 Là Gi ? 
HER-2 là thụ thể trên màng tế bà o. 
T huộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng . 
Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là EGFR. 
Bản chất là một glycoprotein xuyên màng . 
Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số 17. 
Thúc đẩy tăng sinh , sinh mạch tế bào . 
Tế Bào Thượng Bì Và Thụ Thể HER-2 
Thụ Thể HER-2 trên màng tể bào 
Mô hình tế bào và thụ thể HER-2 
Adenovirus 
tất cả các Adenovirus đều không có vỏ , đường kính 60-90nm. 
genome của adenovirus là phân tử DNA sợi kép không phân đoạn 
Bộ gene của adenovirus có thể mang gene mục tiêu > 30kb 
Không gắn vào bộ gene tế bào vật chủ nhưg có thể biểu hiện gene 
Adenovirus gây ra bệnh cảm cúm 
Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ 
Xuyên màng 
Tạo vỏ bọc bằng vật chất tế bào vật chủ 
Gắn lên thụ thể màng nhân 
Bơm vật liệu di truyền 
Nhóm 10: shptyd 
Xây dựng Ad5-Tab Adenovirus tái tổ hợp . 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 1 . Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES. 
Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette 
inserteda t E1 region. Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide, 
are linkedb y IRES. VL, variable region of light chain; CL, constant region of light 
chain;VH , variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain; 
SP, signal peptide. 
Nguyên liệu 
Trastuzumab thương mại : một loại kháng thể đơn dòng đã được thương mại hóa . 
Vector pDC315, pBGHE3. 
Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera. 
Các loại kháng thể . 
Các dòng tế bào 
HEK293: dòng tế bào thận phôi người . 
SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng người (HER-2+). 
BT549: tế bào bình thường (HER-2-). 
L-02: tế bào gan người bình thường . 
Phương pháp và kết quả 
Nội dung thí nghiệm 
Xem xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab. 
Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab. 
Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể . 
Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab. 
Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột . 
Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể . 
Xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab 
Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh thai bò . 
Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t 0 =37 0 C, CO 2 =5%). 
Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh . 
Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ cao . 
Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab 
Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết thanh thai bò . 
Thu hoạch các tế bào nổi ( vào ngày thứ 3 và thứ 7). 
ELISA 
Kháng thể đơn dòng mAb anti-human IgG1 chuột làm bất động kháng thể tạo ra do Ad5-Tab. 
mAb tiếp hợp với horseradish- peroxidase . 
Đọc bằng Microplate reader với bước sóng 450nm. 
Sơ đồ 
Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab ( trong tế bào L-02). 
mAb 
horseradish- peroxidase 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 2 . In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The L-02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10. Cell culture supernatants were harvestedat different time points after infection for protein analysis. A, ELISA analysis of supernatants of Ad- TAb - infected L-02 cells. 
Kết Quả 
Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab Western Blot 
Các tế bào : dịch nổi , huyết thanh chuột , trastuzumab thương mại điện di trên SDS-PAGE 12%. 
Ở điều kiện khử và không . 
Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên màng nitrocellulose. 
Dò với goat anti-human IgG1 (H+L) polyclonal ( gắn với horseradish peroxidase ). 
Sơ đồ 
Điện di 
SDS-PAGE 12% 
Khử 
Không khử 
Màng nitrocelluse 
dò 
Các bản sao kháng thể dê kháng IgG1 người . 
Kháng thể thỏ kháng IgG dê 
Horseradish peroxidase 
Huyết thanh chuột , Trastuzumab , Ad5-Tab 
X-RAY 
chemiluminescent 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 3 . Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and reducing (C) conditions 
Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể . 
Rửa SKOV-3 và BT549 bằng PBS ba lần . 
Cố định bằng paraformaldehid 4% (5 phút ). 
ủ với dịch nổi hoặc trastuzumab (4 0 C, 2h). 
Kháng thể thỏ kháng IgG người tiếp hợp với FITC. 
Quan sát tế bào được đánh dấu dưới kính hiển vi huỳnh quang . 
Nhóm 10: shptyd 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 4 . Specific binding of anti-HER-2 antibody expressed byAd5-TAb.Two cell 
lines SKOV-3 and BT549 are chosen for this binding specificity determination. Cell 
culture supernatant from Ad5-TAb - infectedL-02 cells was used, and commercial trastuzumab was usedas 
control. Immunofluorescent microscopy analysis for the specific binding of anti- 
HER-2 antibody to HER-2. A to B, BT549 incubatedw ith supernatant and trastuzumab , respectively. C to D, SKOV-3 
incubatedw ith trastuzumab and culture supernatant, respectively . 
Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab 
Cho 100 µl HER-2 vào các đĩa ELISA. 
Ủ 15h ở 40C, cố định bằng sữa khô không béo 5%. 
Trộn với protein HER-2 trong albumin huyết thanh bò 1%. Ủ trong 1h ở 200C. 
Chuyển vào đĩa ELISA. 
Cho Horseradish peroxidase vào . 
3,3’-diaminobenzidine nhận màu của peroxidase . 
Đọc bằng Microplate reader ở bước sóng 450nm. 
A0/(A0-A)= 1+ (KD/a0). 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 5 . Affinity constant of anti-HER-2 antibody. Indirect ELISA was applied for 
estimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration of 
anti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 × 10 - 5 to 5.0 × 10 - 5 mg/ 
mL , andt hen 2.5 × 10 - 5 mg/ mL was appliedf or the determination of affinity 
constant. Straight slope is the affinity constant of the antibody . 
Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột . 
Tiêm tế bào SKOV-3 vào chuột . 
Chuột đã được tiêm Ad5-Tab thông qua đường tĩnh mạch . 
10 con chuột được lấy máu ở các thời điểm khác nhau . 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 6 . Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculated 
nudemice . Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 10 9 
plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14, 
21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by 
indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradish 
peroxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody. Points, 
mean ( ng/mL ); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point. 
Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể . 
Thí nghiệm 1: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 ba ngày . 
Thí nghiệm 2: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 16 ngày 
Có 2 nhóm : Nhóm 1 được tiêm Ad5-Tab 
 Nhóm 2 ( đối chứng)được tiêm Ad5-LacZ. 
So sánh thể tích khối u chữa trị bời 2 phương pháp và giữa 2 thí nghiệm . 
Nhóm 10: shptyd 
Fig. 7 Antitumor activity of Ad5-TAb -generated anti-HER-2 antibody via gene transfer in tumor-burdened nude mice. A, early stage with smaller size ( ˜ 20mm 3 ). B, late stage with large size ( ˜ 200 mm 3 ). 
Nhóm 10: shptyd 
Tổng kết  
Trastuzumab 
Là một kháng thể đơn dòng có tác dụng chữa bệnh ung thư đã được kiểm chúng và công nhận bởi FDA. 
Phương pháp này sử dụng còn hạn chế do chi phí cao và khó thực hiện . 
Nhóm 10: shptyd 
Ad5-Tab 
Đơn giản và có hiệu quả hơn phương pháp protein kháng thể truyền thống . 
Mở ra hướng mới để điều trị ung thư và các bệnh khác . 
Tuy nhiên đây chỉ mới là thử nghiệm ban đầu , cần phải nghiên cứu thêm . 
Hiệu quả chữa trị tốt nhất ở giai đoạn còn sớm . 
Nhóm 10: shptyd 
cảm ơn thầy cô và các bạn đã lắng nghe! 
Nhóm 10: shptyd