Tiểu luận Vi khuẩn Bacillus Cereus

chiên, 	mì ống, phở**CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐEmetic SyndromeBảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. CereusTên của độc tố CereulideCấu trúc của độ Chuỗi pp [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]Khối lượng phân tử 1.2 kDaSinh kháng thể Không (none)Hoạt động sinh học trên người Gây nônCơ quan nhận cảm 5-HT3Cytotoxic NoHoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bàoKhả năng chịu nhiệt 90 phút ở 1210CẢnh hưởng của sự phân giải protein KhôngViệc sản sinh ra độc tố như thế nào (not known, but probably enzymatically)*Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố dựa trên sự bất thường của depsipeptide từ 13C liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của 13C là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40% 13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide.*CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ*Diarrheal Syndrome	- Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người sau khi ăn thịt hầm với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105. Lần đầu tiên bùng phát (1992), 17 – 24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu nặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h). Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995.	- Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng.*CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ*Diarrheal SyndromeBảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus Đặc tínhLiều gây nhiễm 105/g hoặc /mlĐộc tố được sản sinh ra Trong ruột nonLoại độc tố ProteinThời kỳ ủ bệnh 8 – 16hKhoảng thời gian mang bệnh 12 – 24hTriệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn*CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ*Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát.*CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ*CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH- Các phương pháp truyền thống: Phương pháp đếm khuẩn lạcPhương pháp MPN- Các phương pháp hiện đại:Phương pháp RPLAPhương pháp ELISAPhương pháp PCR**PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG**Ưu & nhược điểm- Ưu điểm:Không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền- Nhược điểm:Độ nhạy không caoYêu cầu kỹ năng thao tácTốn nhiều hóa chấtThời gian phân tích lâuTốn nhiều nhân công**Các đặc tính của Bacillus nhóm 1Đặc tínhLoàiB.cereusB.thuringiensisB.mycoidesB.anthracisB.megateriumGram+(a)++++Catalase+++++Di động+/-(b)+/--(c)-+/-Khử nitrate++++-(d)Phân hủy tyrosine+++/--(d)+/-Kháng lysozyme++++-Phản ứng với lòng đỏ trứng++++-Lên men glucose++++-Phản ứng VP++++-Sinh acid từ manitol----+Tan máu (cừu)+++-(d)-**Phương pháp truyền thốngPhương pháp đếm khuẩn lạcMẫuĐồng nhất mẫuPhân lậpKhẳng địnhĐếm số khuẩn lạc điển hìnhTest sinh hóaNhuộm Gram**Cách tính kết quả:Mật độ (CFU/ml)=AixDi/VAi:số khuẩn lạc trung bình/đĩaDi: độ pha loãngV: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)*Phương pháp truyên thốngPhương pháp MPNMẫu pha loãng vào peptone đệm9 ống môi trường TSPNhuộm Gram, thử sinh hóaChọn ống đục cấy sang MYP ủ 30oC/24-48hChọn khóm hồng có vòng sángTSA thạch nghiêngTra bảng MPN**Các thử nghiệm phân biệt các loài Bacillus nhóm 1Thử nghiệm tính di động: hầu hết các chủng B.cereus; B.thuringgiensis là di động, B.anthracis, B.mycoides không di độngSự hình thành rễ giả: B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, B.mycoides tạo cấu trúc rễ giảThử nghiệm làm tan máu: B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) 2-4µm, B.thuringiensis và B.mycoides cũng làm tan máu, B.anthracis thường không làm tan máu trong 24h Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể:B.thuringiensis tạo tinh thể độc tố, B.cereus và các Bacillus khác không tạo tinh thể độc tố**Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm , Bộ y tế 4/1998Nhóm thực phẩmGới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm)B.cereusNhóm thịtThịt tươi, thịt đông, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biếnSản phẩm chế biến từ thịt: thịt hun khói, patê, xúc xích10210Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ:Cần xử lý nhiệt trước khi dùng: bột, miến, mì sợiDùng trực tiếp không xử lý nhiệt: bánh bột10210Nhóm thức ăn khô và chứa dinh dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc biệtPhải xử lý nhiệt trước khi sử dụngDùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt1010*MỘT SỐ HÌNH ẢNHB.Cereus trên kính hiển vi điện tửKhuẩn lạc B.cereus trên môi trường thạch máu cừu**B.Cereus không tạo cấu trúc rễ giảB.mycoides tạo cấu trúc rễ giả**Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MosselKhuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP**PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠIBCET – RPLA (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination )BDE - ELISA (Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual ImmunoAssay )PCR**PHƯƠNG PHÁP BCET – RPLANguyên tắc:Phương pháp LA (latex agglutination)Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutination)**PHƯƠNG PHÁP AGGLUTINATIONKháng nguyên dạng hạtKháng thể**PHƯƠNG PHÁP RPLA : Bộ KIT BCET – RPLA (OXOID TEST KIT)Hạt latex (polystyrene 0.81 µm) gắn kháng thể đăc hiệu IgG (thỏ) kháng nguyênKháng nguyên hoà tanHạt latex tụ lại***Bộ Kit BCET – RPLA (Oxoid test kit)12*PHƯƠNG PHÁP ELISA-VIA Nguyên tắc phương pháp Elisa sandwich:*****Bộ BDE - Tecra kit test**Kết quả:**Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ).PHƯƠNG PHÁP PCR*B.cereus PCR kit test (Takara): xét nghiệm 2 loại genCRS (cereulide – emetic toxin) của B.cereusLE (lecithinase ezyme gen) của các loài Bacillus*Chu kì bắt đầu 94oC / 30s 55oC/ 30sChạy điện di72oC / 30sChuẩn bị mẫuPhản ứng PCR lặp lại 40 lầnPhương pháp PCR**Kết quả:1) Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp2) Lecithinase (LE) gene: 227bp3) Internal Control (I.C.): 106 bp *Detection Real Time qPCR KitprimerbufferSYBR GreenDNAdNTPsTag* Ưu điểm: dễ sử dụng, nhạy, hiển thị và theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang diễn ra Nhược điểm: do SYBR liên kết với bất kỳ một DNA mạch kép nào trong phản ứng nên dẫn đến kết quả cao hơn so với nồng độ đích.Phương pháp Real Time qPCR**Duỗi xoắn DNA 94oC / 30s Gắn mồi 58oC/ 45s/30 lầnChạy điện diKéo dài 72oC / 1phChuẩn bị mẫuPhản ứng PCRDuỗi xoắn DNA 94oC / 45s Gắn mồi 65-55oC/ 45s/30 lầnChạy điện diKéo dài 72oC / 45sChuẩn bị mẫuPhản ứng PCRGen HblAGen BceTGen entFMDuỗi xoắn DNA 94oC / 45s Gắn mồi 52oC/ 45s/30 lầnChạy điện diKéo dài 72oC /1phChuẩn bị mẫuPhản ứng PCR*PHƯƠNG PHÁP PCRMultiplex PCR:Hỗn hợp PCR có nhiều cặp mồiPhương pháp phát hiện nhanh nhiều đoạn gen trong cùng một phản ứngƯu điểm: Giảm thời gian phân tích mẫu**BCET-RBLA test kitTecra BDE test kit ( ELISA - VIA)PCR***********B. cereus group – Bal gen – PCR test . Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: B. cereus NCIM 2106, Lane 2: B. subtilis NCIM 2545, Lane 3: Salmonella Dublin ATCC 15480, Lane 4: E. coli MCIM 2068, Lanes 5-10: B. cereus isolates, Lane 11: Staphylococcus aureus NCIM 2079, Lanes 12-15: B. cereus isolates. *NHẬN XÉT:ELISA-BDE cho kết quả dương tính với các dòng B.cereus có độc tố NHE (Omnii & Nduhiu, 2005; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ) với độ nhạy 1ng/ml dịch thực phẩm bị nhiễm.BCET – RPLA cho kết quả dương tính với dòng có độc tố HBL, chạy PCR kiểm tra có sự hiện diện của gen hblA (Sanjoy Das et al.,2007;Mantynen & Lindstrom, 1998,..), có độ nhạy cao với protein L2/HBL (Douglas J.Beecher et al.,1994), 2ng/ml81% dòng B.cereus sinh độc tố NHE, 53% dòng sinh độc tố HBL, 18% dòng cho cả 2 loại độc tố này trên tổng 96 loài (Omnii & Nduhiu, 2005)65% cho kết quả dương tính với Tecra test, 51% với BCET-RPLA test (Beattie & Williams, 1998).Primer BalF/BalR khuyếch đại đoạn gen 533bp đặc hiệu cho nhóm B.cereus (Sanjoy Das et al.,2007)**Độc TốThành phần độc tốProteinGen mã hoáPhương pháp phát hiệnDiarrhoel enterotoxinsHemolytic enterotoxin (HBL)L2hblCBCET-RPLA test kit PCRL1hblD(B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination - Oxoid test kit) BhblAphát hiện protein L2/HBLNonhemolytic enterotoxin (NHE)NheAnheATecra BDE ( ELISA - VIA)NheBnheBBacillus Diarrheal Enterotoxin visual immunoassay - Tecra kit test)NheCnheCphát hiện protein NheA 45kDa / NHEEnterotoxin TbceT Cytoxin KcytK-1cytK-1 cytK-2cytK-2 Enterotoxin FMentFMentFM Emetic toxin (Cereulide)Cereulide Ces ( CRS)Sperm motility test (Swensson et al.,2005;)*Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ).*KẾT LUẬNB.cereus có 2 loại độc tố:Diarrhoeal enterotoxin,thời gian ủ bệnh dài 8-16h, gây ngộ độc tương tự loài Clostridium perfringens, bất họat ở 56oC/30phút, sống ở pH 4-11.Emetic toxin (cereulide), thời gian ủ bệnh ngắn 1-6h , gây ngộ độc tương tự loài Staphylococcus, bất họat ở 120oC/90ph, sống ở pH 2-11. Phương pháp miễn dịch :ELISA-BDE dương tính với độc tố NHEBCET-RPLA dương tính với độc tố HBLB.cereus phát triển ở 35-40oC. Các thực phẩm sau khi nấu chín để nguội dễ bị nhiễm b.cereus, cần bảo quản thực phẩm trên 60oC.Diarrhoel enterotoxins*