Tin Sinh học - Bài 5 Phân tích trình tự chuỗi ADN và thiết kế mồi cho PCR

BÀI 5PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ CHUỖI ADN VÀ THIẾT KẾ MỒI CHO PCRNgười hướng dẫn: TS. Võ Văn ToànHọc viên: Lê Thị Tuyết MaiLớp : Sinh học thực nghiệm K145.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.1. Dự đoán genCác phương pháp máy tính hiện nay để định vị gen trong DNA được dựa trên những đặc tính thống kê của chuỗi nucleotide, chẳng hạn như sử dụng codon hoặc sở thích vị trí. Những phương pháp này đòi hỏi một bộ đào tạo được xác định, mà chỉ có thể thu được từ trước đó xác định các gen mã hóa protein. Vì vậy, các công cụ dự đoán gen hiện nay được tối ưu hóa cho một số lượng hạn chế của các sinh vật. 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.1. Dự đoán genMột danh sách các phần mềm dự đoán gene có sẵn tại  Việc ưu đãi về vị trí được thể hiện bởi mối tương quan giữa nucleotide liền kề trong chuỗi DNA nhiễm sắc thể. Nó có nghĩa là nếu chúng ta có một nucleotide của loại A bên trong một gen, thì chúng ta sẽ tìm thấy một nucleotide của B nhập vào các vị trí tiếp theo với một tần số có thể khác biệt với tần số của B nucleotide trong một vùng không mã hóa. Mô hình này xác suất có thể được mô tả bởi một chuỗi Markov. Một trong những công cụ được GeneMark ( 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.1. Dự đoán genChương trình GeneMark được truy cập vào các tiềm năng mã hóa protein của một chuỗi DNA (trong một cửa sổ trượt) bằng cách sử dụng các mô hình Markov mã hóa và vùng không mã hóa. Cách tiếp cận này là nhạy cảm với các biến thể của mã hóa tiềm năng của địa phương, và các đồ thị GeneMark hiển thị chi tiết của việc phân phối tiềm năng mã hóa cùng một chuỗi. Chương trình GeneMark.hmm xác định phân tích tối đa khả năng của các chuỗi protein mã hóa toàn bộ vào gen (với intron có thể) và khu vực intergenic( 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.1. Dự đoán gen*Đối với phân tích ADN từ các sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn thấp, GeneMark và GeneMark.hmm đã được bao gồm trong một công cụ dự đoán kết hợp ( *Khi một gen giả định đã được xác định, công cụ dịch thuật cho phép để lấy được chuỗi axit amin từ chuỗi DNA bằng cách dịch trong ba khung đọc ở cả hai hướng (5 '→ 3' và 3 '→ 5'). Phổ biến nhất là các công cụ dịch thuật EXPASY ( 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer PCR (Polymerase Chain Reaction) bây giờ là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong nghiên cứu sinh học và y sinh. Cơ chế của PCR là khuếch đại một đoạn DNA dựa trên một cặp mồi, polymerase ADN và một số hóa chất cần thiết. PCR là tiết kiệm thời gian và nhạy cảm, tuy nhiên, sai tín hiệu của phản ứng là một vấn đề nghiêm trọng 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer Các nguyên nhân phổ biến này là ô nhiễm, tự dimerization và không chính xác ủ để DNA mẫu của mồi. Thiết kế mồi là một bước quan trọng trong chiến lược PCR. Về mặt lý thuyết, các tiêu chí cho việc lựa chọn một cặp mồi là đơn giản nhưng rất nghiêm ngặt. Một số tính năng của mồi như chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ gắn mồi ... nên được thực hiện để đảm bảo rằng phản ứng PCR là thành công và các sản phẩm khuếch đại được sản xuất. 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer  Hướng dẫn tính toán để kiểm tra các tính năng cho trình tự nucleotide nhiều sự lựa chọn tốt nhất là rất nhiều thời gian. Ngày nay, nhiều chương trình máy tính đã được xây dựng bởi các nhà nghiên cứu tin sinh học để giải quyết vấn đề này. Phần mềm thương mại, thường được độc lập các chương trình, được bán với giá cao, và các dịch vụ dựa trên web là miễn phí nhưng chất lượng của các đã được thảo luận 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer Thông thường, một phần mềm thiết kế mồi có thể tính toán nhiệt độ nóng chảy, các xu hướng hình thành vòng kẹp tóc, dimer của mồi, và cũng là dị-dimer của mồi phía trước và ngược lại. 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer Một mồi nên vượt qua các yêu cầu này:1. Bám một cách chính xác với mẫu DNA. 2. Primer chiều dài phải ở trong phạm vi 18-30 nucleotide. 3. % GC nên trong khoảng từ 50 - 60% 4. thiết bị đầu cuối kết thúc 3 'nên bám chặt vào các mẫu DNA 5. Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 48 - 65oC * 6. Tránh hình thành vòng kẹp tóc, dimer tự và dị dimer-** 7. Sự khác biệt trong nhiệt độ nóng chảy của mồi phía trước và ngược lại thì không cao hơn 5oC 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer Như vậy là một số phương pháp để tính toán nhiệt độ nóng chảy của mồi: 1. 2AT 4 phương pháp GC: Tm = 2 * (A + T) + 4 * (G + C) 2. GC% các phương pháp: Tm = 64,9 41 * (GC-16,4%) / chiều dài 3. Hàng xóm gần nhất-các phương pháp: Tm = DH / (DS + R * ln (C / 4)) 16,6 * log ([K +] / (1 0,7 [K +]))- 273,15 (DH, DS là entanpy và Entropy của trình tự nucleotide tương ứng) 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer ** Vòng Hairpin 3'-GGGAAA            | | | |   TATCTAGGACCTTA    Tự-dimer 3'-GGGAAAATTCCAGGATCTAT             | | | | | | | |    TATCTAGGACCTTAAAAGGG-3 '    Dị-dimer               5'-TATCTAGGACCTTAAAAGGG      |||||      3'-CATGGAAACTAGGGAC 5.1. Bối cảnh và lý thuyết 5.1.2. Thiết kế Primer Trong phần này, học viên sẽ được huấn luyện để biết cách sử dụng FastPCR - một phần mềm miễn phí - để thiết kế mồi cho phản ứng PCR.   Để tìm các khung đọc mở có thể có trong một trình tự DNA, chúng ta sử dụng một chương trình có tên là ORF finder của NCBI. Chương trình này sẽ tìm kiếm những khung đọc mở có thể có của trình tự nhập vào và trình tự bổ sung của nó. Sau đó đưa ra bản đồ khung đọc mở với các trình tự đã dịch mã thành trình tự amino acid.Bước 1: Từ google chúng ta nhập vào từ khóa orf finderBước 2: Mở trang ORF finder từ trang chủ NCBI bằng cách nhấn vào dòng ORF finder.Nhập trình tự các nucleotid bên trên vào ô or sequence in FASTA formatBước 3: Nhập trình tự DNA vào hộp trình tự (sequence in FASTA format) hoặc mã số trình tự vào hộp GI or ACESSSION (nếu muốn dùng toàn bộ trình tự trong cơ sở dữ liệu).•	Lựa vị trí dịch mã (From:	 To:	 ) và kiểu mã di truyền.•	Nhấn nút OrfFind để thực hiện chương trình. (Xem hình trên)Đợi kết quả xuất hiện sau vài phút (hoặc có thể lâu hơn). Kết quả có sáu khung dịch mã xuất hiện. Các khung đọc mở (nếu có) sẽ là những thanh có màu sậm hơn. Lựa chọn giới hạn cách thể hiện bằng trị số trong mục Redraw (50, 100, 300).Kết quả thể hiện có dạng tương tự:Nhấn lên trình tự khung đọc mở sẽ thấy hiện lên trình tự DNA và trình tự dịch mã amino acid tương tự kết quả bên dưới.Nhấn lên trình tự khung đọc mở sẽ thấy hiện lên trình tự DNA và trình tự dịch mã amino acid tương tự kết quả bên dưới.5.2. Thiết kế mồi Thiết kế mồi cho gen cytochrome P450 (GenBank nhập số: 13699817) để khuếch đại một sản phẩm DNA: khoảng 500bp Khởi động chương trình với các thông số mặc định, bạn nhận được bao nhiêu cặp mồi? Mở cửa sổ " PCR primers or Probes design options ", trong thẻ " General primer design options ", hãy đánh dấu " Show all possible primers " Đóng lại. Khởi động lại chương trình, bạn nhận được bao nhiêu cặp mồi? Hãy cố gắng tăng số lượng tối đa đoạn mồi có thể đến 3000. Chạy chương trình và chọn cặp mồi của bạn. Xác định vị trí cặp mồi của bạn, sản phẩm PCR của bạn tốn bao lâu. Xác định nhiệt độ nóng chảy, GC% và nhiệt độ ủ của phản ứng PCR với mồi của bạn được thiết kế.XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN QUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN!