Bài giảng Điện di polyacrylamide gel

II.Điện di polyacrylamide gelcấu trúc của acrylamideM= 71 Điện di polyacrylamide gelcác gốc tự do (ammonium persulphate)TEMED(N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine) Acrylamide polymer hóa M= 71 II.Điện di polyacrylamide geldạng gel polymer hóa bisacrylamide (N,N’-methylenebisacrylamide) Điện di polyacrylamide gelĐiện di polyacrylamide gelchiều dài chuỗi mứcđộ liên kết chéo nồng độ acrylamide Mức độ liên kết chéo Độ xốp của gelĐiện di polyacrylamide gelHình 2.7. Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gelĐiện di polyacrylamide gelHầu hết các dung dịch acrylamide được ngăn không tiếp xúc với không khí để hạn chế sự ức chế trùng hợp gây ra bởi oxygen.Gel có thể dài từ 10-100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng.Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Từ những vấn đề đó chúng ta có thể tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein.Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điện di polyacrylamide gelII.1.Điện di protein1. Điện di SDS-PAGE2. Điện di 2D-PAGE1. Phương thức 2. Khử SDS-PAGE3. Điện di và nhuộm 4. Hệ thống đệm Điện di polyacrylamide gelĐiện di polyacrylamide gel1. Phương thức Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Điện di polyacrylamide gelBổ sung SDS làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử [cấu trúc sơ cấp, hoặc số lượng (và kích thước) của các amino acid] SDS liên kết với protein theo tỷ lệ khoảng 1,4 g SDS trên 1,0 g protein tạo ra một tỷ lệ khối lượng/điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein để sự dịch chuyển qua gel chỉ liên quan đến kích thước của protein Điện di polyacrylamide gel1. Điện di SDS-PAGEĐiện di polyacrylamide gelHình 2.9. Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue. WM: Chuẩn khối lượngphân tử của protein. Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein.Điện di polyacrylamide gel2. Khử SDS-PAGESDS tác nhân khử được đun nóng nhanh gần đến sôi dithiothreitol (DTT) hoặc 2-mercaptoethanol (BME) Biến tính thêm protein bằng cách khử các liên kết disulfide Điện di polyacrylamide gel3. Điện di và nhuộm nạp các protein biến tính vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệm thích hợp sử dụng dòng điện từ đầu này đến đầu kia của gel sẽ làm cho các protein tích điện âmdịch chuyển qua gel Điện di polyacrylamide gelSau một vài giờ các protein sẽ có sự dịch chuyển khác nhau dựa trên kích thước của chúng,Quá trình điện di thường được chạy kèm với protein marker của các khối lượng phân tử đã biết ở một đường riêng biệt trong gel Điện di polyacrylamide gelNếu protein không được đánh dấu phóng xạ, thì sau khi điện di để nhìn thấy được sự phân tách của các băng protein chúng ta cần phải tiến hành nhuộm gel. Sự lựa chọn phương pháp nhuộm được xác định dựa trên  nhiều yếu tố bao gồm: độ nhạy, giải  nhuộm, tiện dụng, tính kinh tế, thiết bị nhuộm, thiết bị đọc sẵn có.Coomassie Brilliant Blue G- 250 nên sử dụng để nhuộm đối với những protein có trọng lượng phân tử polypeptide thấp Điện di polyacrylamide gelNhuộm bạc là phương pháp rất nhạy đối với protein và nên sử dụng nhuộm gel khi điện di để đánh giá sự tinh khiết của mẫu protein. Nhuộm bạc cho phép phát hiện một cách nhanh chóng và nhạy các  băng protein trên gel ngoại trừ những protein không được phân tách trên gel.Điện di polyacrylamide gel thường là chọn lựa đầu tiên khi thử nghiệm sự tinh sạch protein do tính đáng tin cậy và dễ dàng của nó Điện di polyacrylamide gel4. Hệ thống đệm Hệ  đệm quyết định nhu cầu về năng lượng và ảnh hưởng đến sự phân tách protein.Hệ đệm bao gồm đệm dùng để pha gel và đệm dùng để chạy điện di. Hầu hết điện di phân tách protein được thực hiện với một hệ thống đệm không liên tục tăng cường một cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel Điện di polyacrylamide gel2. Điện di 2D-PAGEKỹ thuật điện di hai chiều trên gel polyacrylamide (2D-PAGE) là một kỹ thuật có khả năng phân tích hơn 1.800 protein trên cùng một bản gel, nó là một công cụ quan trọng cơ bản trong những thí nghiệm mà các protein phức tạp được tách ra để phân tích đồng thời Điện di polyacrylamide gelCác bước cơ bản trong kỹ thuật 2D-PAGE 1.Chuẩn bị mẫu và làm hòa tan mẫu (Các yếu tố như độ tan, điện tích, kích thước và điểm đẳngđiện của protein đều được lưu ý trong quá trình chuẩn bị mẫu) 2.Điện di theo chiều thứ nhất Protein được tách ra dựa trên điểm đẳng điện pI của chúng, ở pH mà proteinkhông tích điện và không di chuyển trong điện trường.Kỹ thuật này được gọi là isoelectric focusing (IEF). Điện di polyacrylamide gel3.Cân bằng trạng thái của protein(gây biến tính và đồng nhất về điện tích ) xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol, các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S–S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 trở thành chuỗi polypeptide và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều được tích điện âm 4.Phân tách protein theo chiều thứ hai Dưới tác dụng của điện trường do protein mang điện tích âm sau khi cân bằng trạng thái nên protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Điện di polyacrylamide gel5.Nhuộm protein Để có thể nhìn thấy được protein sau khi điện di, gel phải được nhuộm, trừ khichúng ta đã đánh dấu protein. Sự lựa chọn phương pháp nhuộmđược xác địnhdựa trên nhiều yếu tố bao gồm độ nhạy, dải nhuộm, tiện dụng, tính kinh tế, và thiết bị nhuộm,thiết bị đọc sẵn có. 6.Thu nhận và phân tích  hình ảnh protein Việc thu nhận hình ảnh theo kỹ thuật số là một trong những yếu tố quan trọng làmcho phương pháp 2D-PAGE là phương tiện thực  tế trong việc thu nhận dữ liệu trong nghiên cứu (Phần mềm PDQuest )Điện di polyacrylamide gelĐiện di polyacrylamide gelĐiện di polyacrylamide gelHữu ích cho việc so sánh các mẫu liên quan như mẫu mô bình thường và mẫu mô đột biến. Tìm kiếm các protein mà sự biểu hiện của chúng rất tương đồng dưới cùng một tập hợp các điều kiện. Nhận dạng các protein được sản xuất trong phản ứng với liệu pháp thuốc. Điện di polyacrylamide gel1 Nghiên cứu trong nước ứng dụng điện di protein SDS- PAGENăm 2007, Phạm Văn Phượng (Đại học Cần Thơ) đã ứng dụng kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein để nghiên cứu đặc điểm di truyền và chọn giống lúa. Kỹ  thuật điện di SDS-PAGE protein đã giúp nhà chọn giống sớm tuyển chọn chính xácnhững cá thể mong muốn ngay từ thế hệ đầu của các tổ hợp lai nên đã rút ngắn ½thời gian tuyển chọn so với phương pháp truyền thống. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp đánh giá đa dạng di truyền và phân biệt hai loài lúa hoang ở Đồng bằngsông Cửu Long dựa vào mức độ ăn màu Coomassie của băng protein chỉ thị dạng basic glutelin.Điện di polyacrylamide gel1 Nghiên cứu trong nước ứng dụng điện di protein SDS- PAGENăm 2007, Võ Công Thành và ctv (Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ) đã ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE để cải thiện thành công phẩm chất nhiều  giống lúa đặc  sản đang bị thoái hóa của đồng bằng sông Cửu Long. Trong chọn tạo giống lúa,kỹ thuật này giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bật như mùi thơm, protein,amylose để các nhà khoa học chọn lọc được những dòng,giống có phẩm chất tốt.Một số giống lúa đặc sản được cải thiện phẩm chất thành công và nhiều giống lúa triển vọng ra đời bằng kỹ thuật này.