Đề tài Nhân dòng đọc trình tự và biểu hiện trong Pichia pastoris một cDNA xylanase vừa được phân lập từ Aspergillus awamoris

Hướng dẫn: Ths. Trịnh Đình KháNhân dòng đọc trình tự và biểu hiện trong Pichia pastoris một cDNA xylanase vừa được phân lập từ Aspergillus awamorisĐẠI HỌC KHOA HỌCBô môn khoa học sự sốngBài đăng trên tạp chí công nghệ sinh học Châu Phi, tháng 12 năm 2008Thái Nguyên 2009Giới thiệu về xylan và xylanaseXylan là gì?Là một thành phần của hemicelluloses mà cấu tử chính là các xylose.Được coi là một loại polimer sinh học phổ biến (thứ 2 sau cellulose).Xylanase là gì?Một loại protein EnzymeXylanase xúc tác cho phản ứng nội thủy phân liên kết 1-4-β-xylosidicTrong công nghiệp giấyTrong công nghiệp thực phẩmTrong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi (SEBphytase 2MG, Chế phẩm sinh học Trichoderma)Ứng dụng của xylanaseHướng nghiên cứu về xylanase hiện nayTìm kiếm chủng mới có thể sản xuất xylanaseNhân dòng và biểu hiện gen xylanaseChủng giốngAspergillus được thu thậpE.coli JM109 sử dụng như tế bào chủ nhân dòngPichia pastoris tế bào chủ nhân dòng và biểu hiệnNGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPCác môi trường nuôi cấyNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPPhân lập chủng sản xuất xylanaseCác chủng khác nhau bao gồm Aspergillus sp. SH-2016 được phân lập từ các mẫu đất, phương thức phân lập chi tiết thực hiện theo phương pháp đã được Abrusci mô tả (Abrusci, 2005). NGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPPhân lập genChuẩn bị RNA tổng số thực hiện theo phương pháp của Chomozynsky và Sachi (1987)Tổng hợp và khuếch đại cDNANhân dòng gen và đọc trình tựNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPKết quả đọc trình tự gen mã hóa xylanase	Các bước biểu hiện genThiết kế vector biểu hiệnThao tác với DNA và biến nạpTinh sạch và biểu hiện proteinXác định hoạt độ của xylanaseNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPThiết kế vector biểu hiệnThực hiện phản ứng PCR với mồi xuôi có điểm nhận biết của EcoR I mồi ngược có điểm nhận biết của Xho IXử lý vector và sản phẩm PCR với enzyme EcoR I và Xho I. Sau đó nối bằng LygaseBiến nạp vào E.coliTách plasmid từ E.coli đã tái tổ hợp thành côngChuyển vào P.pastoris nhờ tạo lỗ bằng điệnNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPThao tác DNA và biến nạpThao tác DNA, phân lập plasmid, và điện di trên gel agarose được thực hiện theo Sambrock (Sambrock, 2001).Biến nạp vào E.coli được thực hiện theo Chung (Chung, 1989).NGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPTinh sạch và biểu hiện proteinChọn khuẩn lạc chuyển vào môi trường BMGY nuôi cấy qua đêmLy tâm 6000 vòng/10 phút thu tế bàoChuyển sang môi trường BMMY (nuôi trong 3 ngày) được cảm ứng bằng methanolSau khi biểu hiện, dịch lên men lỏng được ly tâm ở 8000 vòng/10 phút ở 4°C thu dịch nổi lấy enzyme thôTinh sạch enzyme bằng cách sử dụng cột NI2±NTANGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPPhân tích hoạt độ enzyme(phương pháp dinitrosalisilic,Miller,1959)Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml dịch xylan trong đệm nitrate 50mM, pH=5. Thêm vào 1ml enzymeỦ ở 50°C trong 30 phútXác định hoạt độ bằng quang phổNGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁP Dựa trên các đặc điểm hình thái sinh lý và hóa sinh Dựa trên kết quả phân tích trình tự gen ITS rDNANhận biết được chủng Aspergillus sp SH-2016 (A. awamori)KẾT QUẢKẾTQUẢCây phân loạiThiết kế được vector biểu hiệnBiểu hiện và tinh sạch proteinKẾTQUẢBiểu hiện được gen sinh xylanase trong Pichia pastorisTinh sạch được enzyme tái tổ hợpKẾTQUẢẢnh hưởng của pH tới hoạt tính của xylanaseKẾTQUẢẢnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của xylanaseKẾTQUẢẢnh hưởng của một số chất đến hoạt tính của xylanaseKẾTQUẢNhóm thực hiện :Nguyễn Hải ChiềuĐoàn Thị HoàiTrương Văn HướngVũ Xuân LãmĐào Thanh QuyênHứa Đức TháiNguyễn Thị Thủy