Đề tài Nuôi cấy in vitro rễ bất định và vi củ cây sâm ngọc linh

NUÔI CẤY IN VITRO RỄ BẤT ĐỊNHVÀ VI CỦ CÂY SÂM NGỌC LINHNhóm:Nguyễn Minh HoàngTrần Hiếu NhânNguyễn Thị Kim ThoaNỘI DUNGĐặt vấn đềGiới thiệu về sâm Ngọc Linh (NL)Quy trình nuôi cấy invitro rễ bất định và vi củ sâm NL.Một số nghiên cứu về sâm NL ở VNKết luận I. Đặt vấn đềSâm Ngọc Linh thuộc 1 trong 5 loại sâm quý nhất thế giới.Cây sâm tự nhiên sinh trưởng và phát triển rất chậm.Nguồn nhân giống hữu tính vẫn chưa đủ khả năng cung ứng số lượng cây trồng. Nghiên cứu nhân giống vô tính và sản xuất sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh qua nuôi cấy in-vitro đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu sâm Ngọc Linh.Mục tiêu Chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào, trong thời gian ngắn.Phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất ra các sản phẩm thực phẩm chức năng, thuốc, v.v..., phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng. SÂM NGỌC LINHII. SÂM NGỌC LINH1.Nguồn gốc và lịch sử phát triển sâm NLSâm NL đã được các đồng bào Trung Trung Bộ dùng như một loại củ chữa bệnh.Năm 1973, khu Y tế Trung Trung Bộ điều tra và phát hiện sâm NL.Hơn 30 năm,sâm NL đã được thế giới biết đến với tên khoa học panax vietnamensis Ha et Grushv.II. SÂM NGỌC LINH2.Đặc điểm sinh học cây sâm NLPhân loại khoa học:Giới	: PlantaeNghành	: MagnoliophytaLớp 	: MagnoliopsidaBộ	 : ApialesHọ  	: AraliaceaeChi 	: PanaxLoài 	: Panax vietnamesis Ha et GrushyII. SÂM NGỌC LINHb.Đặc điểm hình tháiThuộc loại cây thảo, cao 80 - 100 cm. Thân rễ nằm ngang trên hoặc dưới mặt đất độ 1-3 cm, mang rễ con và củ. Hoa mọc giữa các lá thẳng với thân. Quả dài độ 0,8-1,0 cm, rộng khoảng 0,5-0,6 cm, màu đỏ khi chín. II. SÂM NGỌC LINHc.Đặc điểm sinh thái Là cây ưa ẩm chịu bóng,sống lâu, sinh trưởng khá chậm. Mọc dưới tán rừng già ẩm, nhiều mùn, ít ánh sáng,nhiệt độ ban ngày từ 200C – 250C, ban đêm từ 150C – 180C. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ củ. II. SÂM NGỌC LINHc.Phân bố Thường mọc ở độ cao từ 1200 m trở lên. Mọc ở chân núi Ngọc Linh thuộc các huyện Đăk Tô (Kontum) và Trà My (Quảng Nam).Ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, đỉnh Ngọc Am (Quảng Nam)II. SÂM NGỌC LINHd.Thành phần hóa họcChiết xuất được 50 hợp chất, gồm26 hợp chất có cấu trúc đã biết và 24 saponin pammaran có cấu trúc mới. Chứa chủ yếu các saponin triterpenicCó 14 acid béo, 16 acid amin,18 nguyên tố đa lượng, vi lượng.Đặc biệt là chất Majonoside R2 (chiếm 50% hoạt chất saponin).II. SÂM NGỌC LINH3.Tác dụng dược lý của sâm NLTính vị: có vị đắng kéo dài, không độc.Đối với sức khỏe:Làm thuốc cầm máu, lành vết thương, chữa bệnh: sốt rét, đau bụng, chảy máu,...Tăng sức lực ,bồi bổ cơ thể, chống suy nhược, stress, lão hóa, điều hòa hoạt động tim mạch, chống xơ gan và giải độc gan,...III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLKĩ thuật nuôi cấy invitro Khái niệm Là phương pháp tách rời tế bào, mô được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để chúng tiếp tục phân bào rồi biệt hoá thành mô, cơ quan và phát triển thành cây con mới.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NL b.Ý nghĩaCó thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp.Có hệ số nhân giống cao.Cho ra các sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền.Nếu nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh thì sản phẩm nhân giống sẽ hoàn toàn sạch bệnh.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NL c. Các nhân tố đảm bảo thành công. Bảo đảm điều kiện vô trùng.Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLd.Dụng cụ, thiết bị và hóa chấtDụng cụ: Bình tam giác, giấy cấy vô trùng, Bécher, kẹp, dao cấy, đèn cồn, đĩa petri vô trùng.Thiết bị:Autoclave,tủ sấy, tủ cấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, máy cất nước 2 lần, máy khuấy từ.Hoá chất: Đường saccharose, agar, nước cất vô trùng, cồn, xà phòng bột, dung dịch hypochloride calcium 10%...III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NL2. Quy trình a.Điều kiện tiến hành:Ngoại cảnh: -Nhiệt độ: khoảng 18 – 200C -Ánh sáng:Kỹ thuật: -Tiến hành theo qui định nghiêm ngặt của PTN. -Dụng cụ và trang thiết bị đều dược khử trùng. -Môi trường nuôi cấy được hấp và vô trùng. -Các mẫu sau khi cấy được nuôi dưỡng đồng nhất.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLb. Các bước thực hiện.Chọn vật liệu nuôi cấyLà những củ sâm Ngọc Linh 10 năm tuổi.Môi trường: MS có bổ sung 2,4 D, IBA, NAA và các chất dinh dưỡng cần thiết.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLKhử trùng -Phải được rửa thật sạch, sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút.- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1-5 phút.- Tiến hành khử trùng bằng Javen ở các nồng độ khác nhau - Rửa lại bằng nước vô trùng cho thật sạch chất khử trùng.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLTạo mô sẹoSau khử trùng, mẫu được cắt thành từng khối có kích thước 1cm x 1cm x 0,25cm, sau đó cấy vào các đĩa petri để tạo mô sẹo.Là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLSự tạo mô sẹo invitro do 3 quá trình: -Sự phản phân hóa tế bào nhu mô. -Sự phân chia của các tượng tầng. -Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi. Môi trường MS được coi là môi trường thích hợp nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLRễ bất định sâm NL được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2-4D (nồng độ 3mg/l).Môi trường khoáng là môi trường Gamborg (B5), 30g sucrose/l, 8g agar/l.Mô sẹo bắt đầu hình thành sau khoảng 10 ngày nuôi cấyIII. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLTạo rễCác mô sẹo đã đạt tiêu chuẩn -> môi trường tạo rễ. Môi trường nuôi cấy: môi trường MS, White & môi trường Gamborg được bổ sung chất điều tiết sinh trưởng , kinetin, nước dừa và dịch chiết hoài sơn ( củ mài), NAA, IBA. =>Tế bào phát triển tốt hơn và thu sinh khối rễ sâm nhiều hơn.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NL Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng tốt đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy sâm NL là NAA ở nồng độ 3mg/l. Nồng độ đường tối ưu cho sự sinh trưởng rễ bất định và ảnh hưởng đến hợp chất saponin của sâm NLlà 50g/l.III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY INVITRORỄ BẤT ĐỊNH VÀ VI CỦ SÂM NLĐể tạo vi củ, các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi được nuôi cấy trong môi trường lỏng 1/2 MS có 1-3 mg/l NAA. Sau 1-3 tháng, các cụm mô tăng sinh tạo nhiều cụm tế bào mới và tạo rễ, sau đó rễ tăng kích thước hình thành vi củ với nhiều rễ thứ cấp. Tiếp theo ta có thể nhân sinh khối tế bào rễ sâm NL trong bioreactor 5 lít/mẻ, 15 lít/mẻ và 100 lít/mẻIV.MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SÂM NL Ở VNThành lập trại dược liệu Trà Linh nhân giống cây sâm NL.Sản xuất sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng hệ thống bioreactorỨng dung công nghệ biomass tạo sinh khối tế bào rễ cây Sâm NL.Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã bào chế thành công viên nang sâm NLvà nước tăng lực từ tế bào sâm NLV. KẾT LUẬNGóp phần giải quyết những vấn đề bức thiết trong việc tạo nguồn dược liệu phục vụ công tác phòng trị bệnh. Góp phần bảo tồn các nguồn gen quý, bảo tồn thiên nhiên cũng như thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội.Góp phần to lớn vào sự phát triển kinh tế xã hội.KIẾN NGHỊ Cần ứng dụng rộng rãi kỹ thuật nuôi cấy bioreactor với quy mô lớn và tự động hóa trong vi nhân giống.Cần đầu tư hơn nữa về kinh phí, các trang thiết bị và máy móc, đào tạo nguồn nhân lực để các dự án về sâm NL có điều kiện được thực hiện tốt hơn. NGUỒN TÀI LIỆU Kỷ yếu nghiên cứu KH-KT dược nǎm 1971-1975. Bộ Y tế. Nxb. Y học, Hà Nội, 1977. Nguyễn Ngọc Dung. Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamesis) bằng con đường sinh học. Nxb. Nông nghiệp Tp. HCM. 1995.Báo cáo điều tra trữ lượng, khoanh vùng cây sâm K5 Tỉnh Quảng Nam- Đà Nẵng Tháng 9.1979 của Ty y tế Quảng Nam- Đà Nẵng. Báo cáo tóm tắt tổng kết đề tài khoa học áp dụng một số biện pháp kỹ thuật trong tạo giống gieo trồng nhằm bảo vệ, nuôi trồng và phát triển nguồn sâm K5 tại Trà Linh- Trà My (Quảng Nam ) của Công ty dược phẩm Quảng Nam-Đà Nẵng. 1977.