Đề tài Thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng trong chế biến nước tương

ưởng của không khí: - A. oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi có đầy đủ oxy. Vì vậy môi trường phải xốp và thoáng khí.- Theo thực nghiệm trong quá trình nuôi cấy A. oryzae cứ cách 1 giờ môi trường cần 1,7 m3 không khí, nồng độ CO2 là 8%Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: - Hầu hết các chủng A. oryzae có cực đại sinh enzyme protease ở giờ thứ 36 – 42 của quá trình nuôi cấy.Thời gian nuôi cấy để thu được lượng protease cực đại thường được xác định bằng thục nghiệm. - Thời gian nuôi cấy phải phù hợp tránh hiện tượng nấm sinh bào tử vì nó thường làm giảm hoạt lực của enzyme, với A. oryzae hoạt lực sinh enzyme thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử.Ảnh của pH và nhiệt độ: - pH thích hợp cho nấm mốc phát triển là môi trường acid yếu khoảng 5,5 -6 - Nhiệt độ cũng là một yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm mốc và sinh enzyme Trong quá trình nuôi cấy cần giữ cho nhiệt độ môi trường trong khoảng 27 - 36 độ CNuôi cấy nấm mốc Thu nhận sản phẩmKết thúc quá trình nuôi cấy ta tiến hành thu nhận chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm thô.Có thể thu nhận chế phẩm enzyme vào cuối giai đoạn 2 vì ở giai đoạn này protease được tổng hợp mạnh.Sang đến giai đoạn 3 thì lượng bào tử tạo ra nhiều, lượng enzyme tạo ra ít.Sấy: để đảm bảo cho enzyme Protease không bị mất hoạt tính nhanhĐộ ẩm sau khi kết thúc quá trình sấy: 10%Sấy ở nhiệt độ: 38oC – 40oCSấy ở nhiệt độ 60oC – 70oC sẽ làm bất hoạt enzyme protease của A.oryzaeChế phẩm enzyme Protease thô gồm: - Enzyme Protease và các loại enzyme khác - Sinh khối tế bào nấm mốc, thành phần môi trường - Nước có trong môi trườngSấy:Tinh sạch enzyme ProteaseNghiền nhỏ:Mục đích: - phá vỡ thành tế bào - Làm nhỏ thành phần của chế phẩm enzyme thô - Tạo điều kiện cho enzyme nội bào thoát ra ngoài - Giúp các enzyme ngoại bào thoát ra khỏi thành phần tế bào dễ dàng hơnChất trợ nghiền: cát thạch anh và hạt thủy tinhTrích ly:Chế phẩm enzyme thôHòa tan bằng dung môi nướcVới tỉ lệ: 1 phần enzyme thô + 4-5 phần nướcKhuấy nhẹ, lọc lấy dịchBã Dung dịch enzyme thôEnzyme Protease, nước, chất hòa tan trong môi trường nuôi cấyKết tủa ProteaseDung dịch enzyme thôKết tủa enzymeDùng tác nhân kết tủa là ethanol hoặc sunfat amon.Tỉ lệ: 1 phần dd enzyme thô + 2-2,5 ethanol nồng độ 97%Thu nhận kết tủa enzymeKhuấy nhẹ, để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh 4oC-7oCĐộ ẩm lớn hơn 70%W, dễ bị biến tínhSấy phun sương to: 40oCEnzyme Protease tinh khiếtĐộ ẩm 40%W3. Xác định hoạt đô của enzyme Proteasea. Nguyên tắc chung: → Hoạt động của enzyme được xác định thông qua lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành của phản ứng trong một thời gian nhất định. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với [E]=constXác định thời gian cần thiết để thu được lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với [E]=constXác định [E] thích hợp để trong một thời gian không đổi thu được lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm3 cách xác địnhb. Xác định hoạt độ Protease theo phương pháp Gross và FuldNguên tắc chung: - Trong môi trường kiềm yếu casein hòa tan và bị kết tủa khi thêm dung dịch acid acetic trong ethanol, nhưng sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kết tủa. - Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme của 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1mg casein ở 38 độ C trong thời gian 30 phút. - Mục đích là xác định lượng enzyme tối thiểu để phân giải 2mg casein đến mức không bị kết tủa trong điều kiên trênHóa chất - Chuẩn bị dung dịch casein 0,1% : 2 cách chuẩn bị . Cân 0,1g casein hòa tan trong100ml dung dịch cacbonat natri đun ấm cho đến khi hòa tan hết. . Cân 0,1g casein, trộn lẫn với 5ml dung dịch NaOH 0,1N, 25ml nước cất, đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng dung dịch HCl 0,1N điều chỉnh pH=8 thêm nước cất cho đủ 100ml. - Dung dịch acid acetic 1% ( 1ml acid đặc hòa tan với 49ml nước cất và 50ml ethanol 90% ) - Dung dịch enzyme cần xác định hoạt độ: chế phẩm enzyme thu được: lấy 1g chế phẩm đem hòa tan trong 100ml nước cất và giữ ở 38 độ C, lấy ra 1ml để xác định hoạt độ. Tiến hành: - Lấy 12 ống nghiệm đánh số thứ tự, cho vào các ống 1ml nước cất trừ ống số 1 - Cho vào ống số thứ nhất 2ml dịch enzyme - Tiến hành pha loãng: lấy 1ml từ ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 và lần lượt lấy 1ml từ ống thứ 2 cho vào ống thứ 3, cho đến ống thứ 12, hút bỏ 1ml ở ống 12, tức là mỗi ống chứa 1ml dịch enzyme. - Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch casein đã chuẩn bị ở trên, và giữ ở 38°C trong khoảng 30 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá để dừng xúc tác của enzyme. - Nhanh chóng nhỏ vài giọt acid acetic 1% trong cồn rồi xem kết quả. Tính kết quả: - Quan sát các ống nghiệm, tìm ra ống có kết tủa ít nhất. -  Tính hệ số pha loãng của ống dựa vào số thứ tự của ống rồi sau đó tính ra hoạt độ của enzyme.  - Từ số liệu này ta tính được số đơn vị có trong 1 gam chế phẩm theo phương pháp này. Ưu điểm: - phương pháp này đơn giản có thể sử dụng rộng rãi khi nghên cứu các loại chế phẩm khác nhau.Ví dụ: Mẫu ban đầu lấy là 1g chế phẩm hòa tan trong 100ml nước cất. Sau khi cho casein quan sát kết quả, giả sử ta thấy ở ống nghiệm thứ nhất đến ống nghiệm thứ 4 hoàn toàn không có kết tủa.→ kết luận rằng lượng enzyme trong ống thứ 4 là lượng enzyme tối thiểu có khả năng phân giải hòa toàn 1mg casein trong điều kiện tiêu chuẩn. Ở ống nghiệm thứ 4 dung dịch enzyme bị pha loãng 8 lần tương ứng với 0,125ml dung dịch ban đầu. Nhu vậy 1ml dich ban đầu có có hoạt độ là : 2/0,125= 16Vậy 1g chế phẩm enzyme ban đầu có hoạt độ là 1600. đơn vịChú ý: . Nếu kết thúc bước cho acid vào mà tất cả các ống vẫn còn kết tủa thì có nghĩa chế phẩm cần kiểm tra có hoạt độ enzyme yếu→ chuẩn bị dung dịch enzyme có nồng độ cao hơn . Nếu tất cả các ông đều không thấy có kết tủa có nghĩa là dung dịch ban đầu có hoạt độ enzyme cao → cần phải pha loãng dung dịch enzyme trước khi cho vào ống nghiệmc. Xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Vintetle và Vandsmid.Nguyên tắc : - Phương pháp này dựa trên cơ sở xác định nhóm cacboxil của peptide và amino acid được tạo thành do thủy phân protein. - Một dơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khr năng xúc tác thủy phân protein để tạo ra 1mg đạm amine trong 1 giờ ở 40°C và pH thích hợp ( 7,38 hoặc 4.49 )Hóa chất: - Chuẩn bị dung dịch đệm: chuẩn bị dung dịch Na2HPO4 ( cân 11,876g hòa tan thành 1lit)) KH2PO4 ( cân 9,078g hòa tan thành 1 lit) . Đệm pH = 7,38 lấy 8 thể tích Na2HPO4 và 2 phần thẻ tích KH2PO4 . Đệm có pH= 4,49 lấy một thể tích Na2HPO4 và 8 thể tích KH2PO4 - Dung dịch gelatin5%: cân 5g gelatin và làm trương với 15ml trong 15 phút. Thêm 20-25ml dung dịch đệm có pH thích hợp đun tới 80độ C khuấy cho tan, rót vào bình định mức 100ml để nguội tới 20 độ thêm đệm vào cho đủ. - Dung dịch NaOH 0,1N. Dịch chiết enzyme. - Cân P(g) chế phẩm nấm mốc nghiền nhỏ với 5ml - Thêm 10ml dung dịch đệm. - Giữ ở nhiệt độ 30°C Tiến hành : 10ml dd gelatin 6 giọt thimolphtaleinchuẩn độ = NaOH 0.1Nlấy 1ml dịch + 20ml cồn 96°lấy 1ml dịch + 20ml cồn 96°giữ 3 giờ, 40°Cđun cách thủy (40°C) 10 phút+ 2ml dd enzyme, lắc đều Tính kết quả Hoạt độ của protease được tính theo công thức: HđP ( a – ao ).V1,4t.n=đV/ga, ao : số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hoa trong thí nghiệm trước và sau phản ứng enzyme.V : thể tích hỗn hợp phản ứng1,4: số g đạm amine tương ứng với 1ml dd NaOH 0,1Nt : thời gian phản ứngn : số g chế phẩm enzyme tham gia phản ứng ( n= P/100)B. Ứng dụng của Protease trong sản xuất nước tương1. Giới thiệu về nước tươngNước tương: - Nước tương, xì dầu là các sản phẩm thủy phân từ protein thực vật còn gọi chung là HVP (hydrolyzed vegetable protein). - Ở Việt Nam, nước tương là sản phẩm thực phẩm truyền thống được sử dụng phổ biến khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam.Nguyên liệu: - Nguyên liệu sản xuất tương là các nguồn protein thực vật, có thể từ hạt: lúa mì, ngô hạt, đậu nành - Hay từ bánh khô dầu đậu nành, đậu phụng hoặc gluten bột mì, gluten bắp. Sự thủy phân protein là cơ sở của các phương pháp công nghệ chế biến nước tương Công nghệ: Bản chất của sự thủy phân protein là sự thủy phân liên kết peptide.Do liên kết peptide là một liên kết mạnh, sự thủy phân xảy ra trong điều kiện có xúc tác.Tác nhân xúc tác hóa học là axit hoặc kiềm và tác nhân xúc tác hoá sinh học là nhóm enzym thủy phân protein có tên chung là protease.Có 3 phương pháp công nghệ: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzym. Phương pháp công nghệ enzymeTheo đề nghị của công ty Novo quy trình enzyme với 5 enzym được phối hợp sử dụng gồm protease, cellulase, amylase. Quy trình này có ưu điểm là điều kiện thủy phân ôn hòa, hoàn toàn không sử dụng hóa chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu, nhưng hiệu suất tối đa chỉ đat 70%. Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên và bổ sung ưu điểm cho nhau, ta kết hợp thủy phân bằng axit với thủy phân bằng enzym. Việc sử dụng enzym protease kết hợp axit xúc tác quá trình thủy phân có ưu điểm là giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống thiết bị sẵn có. Công nghệ enzyme kết hợp axit Có thể thực hiện thuỷ phân bằng enzym trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzym. Quy trình được lựa chọn như sau:So sánh các phương pháp Quy trình công nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men cải tiếnĐậu nànhHấp chín+ Giống A.ozyzaeLên men+ EnzymeDịch thủy phânNước muối 15-17%VSV gây mùiỦ 1 thángLọcNước tươngBã tươngLên menSấy khôChế phẩmsinh họcSản xuất nước tươngƯu điểm: - Rút ngắn thời gian lên men từ 2-3 tháng còn 1 tháng so với phương pháp lên men bình thường. - Tận dụng bã sau khi lọc để lên men tạo chế phẩm sinh học giàu đạm và enzym dùng trong nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi.Nhược điểm: - Mặc dầu so với phương pháp lên men bình thường diện tích mặt bàng dùng cho sản xuất vẫn ít hơn nhưng so với phương pháp hóa giải chúng vẫn cần nhiều hơn. - Mùi vị nước tương vẫn là của mùi lên men nên ít được người tiêu dùng VN ưa chuộng.