Nuôi cấy mô dịch sinh trưởng

NỘI DUNG1.Giới thiệu chung.2.Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy.3.Nuôi cấy4.Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hiện đại nhất1.GIỚI THIỆU CHUNGMÔ PHÂN SINH ĐỈNH : Mô phân sinh là mô gồm những tế bào còn non hay tế bào phôi luôn phân cắt để tạo ra những tế bào mới, những tế bào mới này sau đó sẽ chuyên hóa để tạo thành mô vĩnh viễn trong cây. - NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH : Trong nuôi cấy invitro, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Hiểu một cách đúng nghĩa thì nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 1 –1,5mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không cao, do đó chỉ được tiến hành khi cần nuôi cấy với mục đích tạo các cây con invitro sạch virus. Trên thực tế người ta thường nuôi cả đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triễn thành cây hoàn chỉnh.2.Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinhtrưởng nuôi cấy - Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm như:khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc Mầm (đỉnh sinh trưởng) → Chồi nách → Cây- Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm Chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá mầm như phong lan, dứa, huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương thức này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể Ví dụ:Hoa lan Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → CâyProtocorm3. Nuôi cấy Theo Champagnat (1977) và Fast (1980), các chồi non đang tăng trưởng dài 10-15cm, vừa mới nhú lá thường được dùng làm vật liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nguyên liệu được rửa sạch dưới vòi nước chảy và là được lột sạch vảy,lá cho đến khi thấy rõ các chồi bên. Chồi non lúc này được nhúng vào cồn 70% và được khử trùng trong dung dịch khử trùng ca(ocl)2 10%.Các chồi bên được lấy ra và rửa trong nước cất vô trùng. Sau đó, chúng được khử lại thêm 10 phút nữa trong dung dịch khử trùng 3% có chứa Tween80 và được rửa lại trong nước cất vô trùng. Trong tủ cấy vô trùng, phần gốc của những chồi nhỏ nhất được cắt bỏ và việc cấy được tiến hành. Trên các chồi lớn hơn, trước hết tách bỏ các lá và phần gốc bị chết do tác động của chất khử trùng,sau đó cấy vào môi trường. Phải mất một thời gian tương đối dài thì protocorm mới được thành lập. Các protocorm này được cắt ra và cấy chuyền vào môi trường mới. Ngày nay, người ta thường cấy các đỉnh chồi lớn hơn (mang 3-4 tiền phát khởi lá) vì dễ thành công hơn là cấy các đỉnh chồi chỉ có 2 tiền phát khởi lá. Nếu protocorm không được cắt khỏi mẫu cấy thì nó phát triển thành chồi và ra rễ, nếu được tách ra khỏi mẫu cấy thì sẽ có sự thành lập các protocorm bất định mới từ các peotocorm ban đầu. Khi cấy đỉnh sinh trưởng của Cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm. Sự thành lập protocorm có thể được tạo ra mà không cần có đỉnh sinh trưởng ngọn. Khi cấy đỉnh sinh trưởng của Cattleya,các mô thường nhanh chóng hoá nâu. Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được vấy trong môi trường lỏng, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào trong môi trường và ít gây ảnh hưởng đến mô cấy (Fast, 1980). Ở Cattleya, người ta thường tách một chồi (3- 5mm) với nhiều tiến phát khởi lá. Môi trường cấy Cattleya thường phức tạp hơn môi trường cấy Cymbidium (Fast, 1980 và Champanat,1977) đôi khi có chứa auxin, cytokinin, nước dừa và peptone. Sự thành lập protocorm ở Cattleya mất nhiều thời gian và luôn được tạo ra ở phần gốc của lá già nhất; thực tế đỉnh sinh trưởng ngọn không đóng vai trò gì cả và mất đi. Việc cấy các tiền phát khởi lá Cattleya cũng có thể đáp ứng cho sự thành lập protocorm. Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơn giản. Cymbidium thường được nuôi cấy trên môi trường khoáng Knudson C hoặc Vacin & Went Đỉnh sinh trưởng thường được cấy trên môi trường đặc (ngoại trừ Cattleya)nhưng protocorm thường được nhân lên trong môi trường lỏng, và protocorm chỉ tăng trưởng thành chồi con khi được cấy trên môi trường đặc,thành phần môi trường thường khác nhau trong từng giai đoạn. Môi trường có pH trong khoảng từ 4,8 –5,8. Nồng độ đường saccharose từ 1-3% hoặc đôi khi là 1,5% glucose + 1,5% fructose. Một số loài lan đơn thân thì không cần đường trong giai đoạn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng vì sự hiện diện của đường có thể làm đỉnh sinh trưởng và và chết. Trong giai đoạn tạo protocorm, thường đường và nước dừa (0-15%) được thêm vào môi trường để kích thích sự thành lập protocorm. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật nói chung không cần thiết, sự hiện diện của chúng trong môi trường có thể làm cơ hội cho đột biến lớn hơn. Nhiệt độ tối ưu cho nhân giống từ 22-28oC. Ánh sáng đèn huỳnh quang thường được sử dụng với 12-16 giờ chiếu sáng/ngày tuỳ vào loại cây nuôi cấy. Có thể nuôi cấy ở cường độ chiếu sáng thấp nhưng cần gia tăng ánh sáng trong giai đoạn tạo chồi từ protocorm. Nói chung có thể thực hiện việc nhân giống từ đỉnh sinh trưởng theo 2 cách: hoặc trên môi trường đặc hoặc trên môi trường lỏng. Trong môi trường lỏng cần lắc vòng với vận tốc rất khác nhau tuỳ theo loài nhưng hầu hết các nhà nghiên cứu thường thực hiện với vận tốc thấp 2-5 vòng/phút. Sự nhân giống trong môi trường lỏng thường tốt hơn trên môi trường đặc bởi vì khi lắc sẽ cung cấp O2 và chất dinh dưỡng cho mẫu cấy hiệu quả hơn. Khi cây con cao khoảng 5-7cm với 3-4 lá có thể mang ra trồng trong vườn ươm. Giai đoạn đưa cây ra ngoài vườn ươm cần chú ý đến các yếu tố ngoại cảnh phải phù hợp với loại cây nuôi cấy mô như: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm..v.v.. Nhưng đặc biệt phải chú ý thường xuyên quan sát để phát hiện kịp thời các biểu hiện xấu của cây để có biện pháp khắc phục kịp thời.4. Phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hiện đại nhất là dùng bioreactor vì dùng bioreactor có thể sản xuất với quy mô lớn,khép kín và giảm nhân công lao độngbioreactorbioreactorTHE END