Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nấm (daldinia concentrica (bolton ex fries) cesati & notaris) ở Việt Nam

LÊ VĂN KHANGChuyên ngành: HOÁ HỮU CƠMã số: 60.44.01.14TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ NẤM (DALDINIA CONCENTRICA (BOLTON EX FRIES) CESATI & NOTARIS) Ở VIỆT NAMBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC VINHVINH 2014LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌCNgười hướng dẫn khoa học :PGS. TS. LÊ VĂN HẠCMỞ ĐẦU1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN2CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM3CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4NỘI DUNGKẾT LUẬN5MỞ ĐẦUNấm là một món quà qúi mà thiên nhiên ban tặng cho con người. 1. Lý do chọn đề tàiVỪA CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNGVỪA CÓ GIÁ TRỊ Y DƯỢCGiá trị của nấmTừ lâu, các tính chấy y dược của nấm đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu. Trong số 14,000–15,000 nấm lớn trên thế giới, khoảng 400 có các tính chất y dược biết được, nhưng dự kiến khoảng 1800 loài có tiềm năng về các tính chất y dược.MỞ ĐẦU1. Lý do chọn đề tàiTrong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của các loài nấm, ở châu Á, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản, ghi nhận sự kéo dài cuộc sống của các bệnh nhân bị ung thư khi uống hay tiêm chiết suất từ nấm.MỞ ĐẦUChính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất từ nấm (Daldinia concentrica  (Bolton ex Fries) Cesati & Notaris) ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của các hợp chất và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành hoá dược.1. Lý do chọn đề tài2. Nhiệm vụ nghiên cứuNhiệm vụ của luận văn: Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ nấm Daldinia Concentrica.2. Nhiệm vụ nghiên cứuSử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất. Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thu được. 3. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết từ loài nấm Daldinia Concentrica ở Việt Nam.CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN1.1. Chi DaldiniaChi Daldinia được xây dựng bởi Cesati & De Notaris (1863) bao gồm những loài của Xylariaceae có quả thể nấm khá lớn, quả nấm dễ tìm thấy trên cây gỗ chết của thực vật hạt kín, dựa trên các vùng đồng tâm bên trong của chúng. Phân bố rải rác trên tất cả các châu lục: Châu Á, Châu Phi, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Úc.Daldinia thuộc nhóm nấm lớn rất phổ biến. Chi Daldinia có hơn 80 loài Daldinia, nhưng chi này chỉ có 25 loài có giá trị.1.2. Nấm Daldinia concentricaTên khoa học : Daldinia concentrica  (Bolton ex Fries) Cesati & NotarisTên khác: Sphaeria concentrica Bolton, Hypoxylon concentricum (Bolton Wanderers) Grev.Đặc điểm thực vậtDaldinia concentrica  cứng, nấm hình bán cầu ( thường không đều). Thịt nấm thường có màu nâu, màu hạt dẻ cuối cùng trở thành màu đen khi chín. Thịt xơ được cấu tạo bằng nhiều lớp đồng tâm.1.2. Nấm Daldinia concentricaBề mặt của quả trưởng thành có xuất hiện mụn chấm. Trong giai đoạn sinh sản vô tính nấm giải phóng bào tử màu đen. Đây là những khe hở được hình thành trên quả thể nối với khoang chứa bào tử hình trụ nằm ngay dưới bề mặt. 1.1.3. Thành phần hóa học của Daldinia Concentrica Allport và Bu'Lock là những người đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học của Daldinia concentrica năm 1958 tìm ra hợp chất Binaphthyl (BNT) và dihydroxyperylene quinone từ thịt quả nấm D. concentricaKhi nghiên cứu D. concentrica ở Đức giáo sư Hashimoto (2002) và các cộng sự không chỉ thu dược BNT, mà còn thu được 13 hợp chất khác: daldinone Adaldinone Bdaldiniapyronedaldinialanone3,4,5-trihydroxy-1-tetralone(+)-orthosporinKhi nghiên cứu về Daldinia concentrica(1996) và một số loài Daldinia nhiệt đới khác Hashimoto,Yukiko và các cộng sự đã tìm thấy các hợp chất cytochalasins.1.1.4. Hoạt tính sinh họcTừ lâu Daldinia concentrica là một loại nấm được sử dụng trong y học cổ truyền châu Phi.Đặng Ngọc Quang và các cộng sự (2012) tìm ra ba hợp chất cho thấy khả năng gây độc chống lại bốn tế bào ung thư, ung thư biểu bì,ung thư vú, ung thư phổi và ung thư biểu mô tế bào gan. Ngoài ra, isocoumarin ức chế sự phát triển của tụ cầu khuẩn, với IC 50 giá trị 87,81 mg mL-1.Một lacton benzofuran mới có tên concentricolide, được phân lập từ thịt quả nấm Daldinia concentrica thể hiện hoạt tính sinh học kháng virut HIV đi vào các tế bào bình thường với liều lượng EC50 0.83 µg/ml.Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM2.1. Phương pháp nghiên cứu2.1. 1.Phương pháp lấy mẫuMẫu nấm được thu hái về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Sau đó chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu.2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chấtĐể phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký như:- Sắc ký lớp mỏng (TLC).	- Cột thường (CC).- Sắc ký cột nhanh (FC).	- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC).- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chấtCấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:- Phổ khối lượng (EI-MS).	- Phổ 1H-NMR.- Phổ 13C-NMR.	- Phổ COSY.	- Phổ DEPT.	- Phổ HMBC.	- Phổ HSQC.	-Phổ NOSEY2.2. Thực nghiệm2.2.1 Hoá chất Dung môi được sử dụng là: n-hexan, metanol (CH3OH), butanol (C4H9OH), etylaxetat (CH3COOC2H5), axeton (CH3COCH3), clorofom (CHCl3), nước cất.2.2.2. Phân lập các hợp chấtMẫu nấm được chiết bằng metanol. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi, rồi sau đó chiết lần lượt với cloroform, etyl axetat, butanol thu được các dịch chiết tương ứng. Dùng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn thu được các chất tinh khiết.Cao clorofom(142 g)Cao etylaxetat(291 g)Cao butanol (155 g)Chất AChất BQuả thể nấm(50kg).Cao metanol (470g)Ngâm với metanol Cất thu hồi metanolPhân bố trong nướcChiết lần lượt với clorofom, etyl axetat, butanolSắc kí cột n-hexan:axeton(4:1)Sắc kí cột cloroform: metanol(1:0-2:1)Sơ đồ: Phân lập hợp chất trong quả thể nấmCHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNChất A là chất rắn vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 217-219°C. M+=467.2669Phổ khối lượng cho tín hiệu: [M]+ = 467,2669 ứng với công thức phân tử C28H37O5NHình 3.1: Phổ MS của chất A3.2. Xác định cấu trúc hợp chất AHình 3.2: Phổ giản 1H – NMR của chất A3H của 3 nhóm OH( δH = 2,25 ; 1,85 ; 1,75)H của nhóm metylHình 3.3: Phổ giản 1H – NMR của chất AH liên kết với N H của Nối đôi olefinH của nhóm exometylenH của ancol bậc 2H của nhân thơmPhổ 1H-NMR cho thấy:Tín hiệu proton H-2 của amid NH (δH 6,35); ba tín hiệu proton của nhóm hydroxyl (δH 2,25, 1,85, 1,75); hai proton của ancol bậc hai H-7 (4,76) và H-19(4,31 ppm). Tín hiệu proton của nhóm benzyl H-2’,6’(7,13), H-3’,5’(7,25) và H-4’(7,28). Ngoài ra còn có hai proton exometylen (δH 5,10; 5,43 ppm), hai tín hiệu proton olefin (δH 6,67; 5,50), ba proton metyl (δH 0,92; 0,91; 1,63)Hình 3.4. Phổ giãn 13C-NMR của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) 4 Nhóm CH2(C-15;C-10;C-17;C-20)2 Nhóm CH- OH(C-7;C-19) Hình 3.5. Phổ giãn 13C-NMR của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) 4 C olefinHình 3.6. Phổ giãn DEPT của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) 2 nhóm C=OPhổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy:Tín hiệu của 28 nguyên tử cacbon : hai cacbon cacbonyl C-21( 213,2), C-1(175,2); sáu cacbon thơm (δC 126,9; 128,8; 130,2; 138,0), bốn carbon olefin (δC 112,7; 131,9; 133,8; 151,8 ppm).Hai cacbon bậc hai gắn oxy (δC 72,4, 70,4), hai cacbon bậc bốn (δC 65,0, 75,8), năm cacbon nhóm metin, bốn cacbon nhóm metylen (δC 44,2; 43,4; 46,3; 45.0 ppm) và ba cacbon nhóm metyl (δC 25,5, 24,1; 13,1 ppm).Hình 3.8. Phổ giãn HSQC của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) H-14H-12H-13C-14C-12C-13H-11H-22C-11C-22C-16C-5Hình 3.7. Phổ giãn HSQC của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) Hình 3.8. Phổ giãnHMBC của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) C-5C-10C-4C-3C-11H-3H-4H-5H-10H-11Hình 3.9. Phổ giãn HMBC của chất A (Pyr – d5, 700 MHz) H-12H-8H-10H-20C-9C-7C-13C-1’C-1C-18Hình 3.10. Phổ giãn COSY của chất A H-15H-11H-15H-14H-8H-14H-5H-13H-7Hình 3.11. Phổ giãn COSY của chất A H-22H-16H-11H-20H-10H-5H-16H-15H-5H-19H-3H-4Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc của hợp chất A là.[11]-Cytochalasa-6(12), 13-diene- 1, 21-dione-7, 18, 19- trihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl-(7S*, 13E, 16S*, 18S*, 19R*)KẾT LUẬNCao etyl axetat được phân tách trên bằng sắc ký nhồi silicagel, dung môi giải hấp là n-hexan : axeton, cloroform : metanol, thu được chất A.Cao n-butanol được phân tách trên bằng sắc ký nhồi silicagel, dung môi giải hấp là: cloroform : metanol, thu được chất B. Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại: Xác định cấu trúc các hợp chất A là [11]-Cytochalasa-6(12), 13-diene- 1, 21-dione-7, 18, 19- trihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl-(7S*, 13E, 16S*, 18S*, 19R*).Hợp chất B là β-D-fructofuranozyl-α-D-glucopyranozit.Nghiên cứu thành phần hoá học của nấm Daldinia concentrica ở Nghệ An, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:LỜI CẢM ƠNVới lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới:PGS.TS. Lê Văn Hạc - khoa Hoá học - Trường Đại học Vinh, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.PGS. TS Trần Đình Thắng- Phó trưởng khoa Hoá học - Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận văn.TS. Nguyễn Tiến Công và PGS.TS. Nguyễn Hoa Du đã có những ý kiến đóng góp quý báu cho luận văn này.Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo khoa Hoá học, khoa Sau đại học - Trường Đại học Vinh; các anh chị nghiên cứu sinh, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm chuyên đề hóa hữu cơ, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.