Tiểu luận Chiến lược tinh chế protein, các phương pháp và ví dụ tinh chế một protein tự nhiên

 gel chính thứ nhất được tạo bởi mạch dextran (polysaccharid), thứ hai có nguồn gốc được tạo bởi các mạch polyacrylamide với tên tương ứng là shephadex và biogel
Gel mua về chưa hoạt hóa cần hoạt hóa bằng cách ngâm trong dung dịch nước, khuấy qua đêm, ngâm 24 h chắc nước đó đi lấy phần gel chìm gạn nổi, cân bằng cấu trúc hạt gel bằng cách cho dung dịch đệm. Kẹp cột gel theo phương thẳng đứng, nhồi gel, khuấy đều, cho ít bông thủy tinh để cản gel. Khi đạt được cấu trúc chiều dài, chặt ta cho dung dịch đệm vào, cân bằng đệm sau đó cho dung dịch protein lên cột và tiến hành thu phân đoạn
2.4.4. Sắc ký ái lực
Là mục tiêu lý tưởng của tinh sạch, mạng lưới chỉ giữ lại protein quan tâm mà không có các phân tử khác
Một kháng thể được gắn liền với hạt nhựa chắc và trơ
Một chất ức chế protease được gắn liền với hạt gel để liên kết protease cụ thể
Một cofactor được gắn với hạt gel để liên kết các enzyme đặc hiệu	
Một ion kim loại gắn với hạt gel để liên kết với protein
2.4.5. Sắc ký tương tác kỵ nước 
Hạt nhựa kỵ nước chứa nhóm chức không phân cực như alkane hay nhóm chức vòng thơm, cơ sở cho năng lượng liên kết ( còn gọi là hiệu ứng kỵ nước)
Tương tác này được tăng cường bằng lực ion làm cho các protein có thể liên kết ở nồng độ muối cao và thôi ra khi giảm nồng độ muối
Các loại cột như vậy không chỉ dùng để tinh chế mà còn loại muối ra khỏi mẫu
3. TINH CHẾ MỘT PROTEIN TỰ NHIÊN
Trong những năm gần đây người ta dành sự quan tâm rất nhiều đến việc tách chiết enzyme bromelin để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, chữa vết thương, ổn định dịch lên men. Nhưng việc nghiên cứu thành công một enzyme không phải ở việc chiết xuất, xác định đặc tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme mà phải tinh chế được enzyme ở dạng sạch, để chế phẩm có hoạt độ cao. Việc tinh chế enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất (các protein không phải enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần thuận lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nhất là nguyên liệu dùng làm thuốc trong điều trị và sản xuất....
Bromelin là một trong các cystein proteinase được tìm thấy nhiều nhất trong dứa. 
Hình 7: Cây dứa
Các enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong y học cũng như trong công nghiệp, bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase. Trong đó đặc biệt bromelin thân có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelin thương mại được trích ly từ thân dứa. Do đó yêu cầu bức thiết được đặt ra là cần có một sản phẩm bột bromelin tinh sạch thuận lợi cho sử dụng, vận chuyển, tồn trữ. Những kết quả nghiên cứu bước đầu trong tinh sạch bromelin từ thân dứa cho thấy enzyme này có thể tủa bằng acetone, tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion trên cột trao đổi cation UNO-S và đông khô bằng máy lyopro 6000. Từ 97 gam thân dứa nhận được 50 ml dịch, sau khi tủa bằng acetone thu được 9 ml dịch tủa, sau khi qua cột sắc ký nhận được 108 ml dịch enzyme tinh khiết với nồng độ là 0.53 mg/ ml ( chiếm 11.7 % protein tổng số), hiệu suất thu hồi hoạt tính 65.65%. Cuối cùng đông khô sản phẩm nhận được 4.6 gam bột bromelin với hàm lượng và hoạt tính enzyme nguyên vẹn sau 4 tuần nếu giữ ở - 200C. kiểm tra qua SDS- PAGE cho thấy sản phẩm bromelin có độ tinh sạch cao
3.1. Nội dung thực hiện
3.1.1. Tổng quan về enzyme bromelin
Đặc điểm của enzyme bromelain
Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật có chứa nhóm –SH, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân, chồi, trái, vỏ).
Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa.
Có khả năng thủy phân mạnh và hoạt động tốt ở pH = 6-8
Trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da
Trong dịch chiết có chứa một ít peroxydase, photphatase acid và chất cản protease
Cấu tạo hóa học
Bromelain là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose.
Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide.
Bromelain có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid (thân), 283-161 amino acid (quả).
Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở đầu carbonhydrate là glycine.
Bromelain quả có amino acid ở đầu amin la alanine.
Cấu trúc không gian
Cấu trúc bậc 1
Ser-Val-Lys-Asn-Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp- Gly-Cys-Lys-
Trong trung tâm hoạt động có chứa cysteine và 2 sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S-.
Phân tử dạng hình cầu.
Trong phân tử có chứa nhóm sulfhydryl , 5 cầu nối –S-S- và các ion Zn2+
có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
Nguồn thu: quả, thân, lá, rễ
3.1.2. Phương pháp thu nhận bromelin
* Phá vỡ tế bào: Qủa thân dứa được xay nhuyễn để phá vỡ tế bào mô dứa. Ta có thể dùng phương pháp đồng hóa để vừa phá vỡ tế bào, vừa giảm độ nhớt của dịch chiết.
* Thu dịch enzyme: Qủa dứa ( chồi) được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã, thu dịch lọc đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng trên phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ, thu được dịch chiết có chứa bromelin
Chồi, thân, lá dứa
Siêu lọc
Lọc
Ly tâm 1
Xay nhuyễn
Hấp phụ
Kết tủa
Sấy
Ly tâm 2
Dịch
Bromelin
Bã 
Bã
Hình 8: Quy trình thu nhận bromelin
3.1.3. Các phương pháp tách chiết protein
3.1.3.1. Phương pháp kết tủa
+ Tủa bằng acetone: thêm 1 ml thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm trong 1 giờ ở nhiệt độ 0 – 40C. Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng /phút, trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích acetone lạnh, để 1h ở 0 – 40C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.
+ Tủa bằng ethanol: làm lạnh dd nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 960 theo tỉ lệ 4 dứa : 1 cồn, trộn đều để ở nhiệt độ 00 C từ 3 – 4h. Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút, trong 5 phút. Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa.
+ Tủa bằng ammonium sulphate: chuẩn bị 1l dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g amonium sulphate vào khuấy đều. Để yên ở nhiệt độ phòng 10-15’, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Phương pháp hấp phụ: Có thể dùng kaolin/betonite để hấp phụ.
Cấu tạo kaolin: cấu tạo thành từng lớp, độ phân tán cao nên tính hấp phụ tốt, có khả năng tạo hình kết dính, kích thước < 1µm, trên bề mặt có chứa nhiều ion OH- và O2- 
Tiến hành: kaolin khô ( hoặc đã ngâm cho trương nở) + dd nước dứa, tỉ kệ 25mg kaolin/ ml dd nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, rồi ly tâm để thu tủa ( là bromelin-kaolin)
3.1.3.2. Phương pháp sắc ký lọc gel
Nguyên tắc
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel.
Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột.
Trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ.
Hình 9: cột chứa gel
Chuẩn bị hoá chất và dụng cụ:
Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ
Phễu đổ gel
Bình hút chân không
Flow Adaptor 1,5 cm 
Cột sắc ký Bio-Rad có kích thước 30x1,5cm
Bình đựng dung dịch đệm
Ống nghiệm 50 cái
Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch
Hóa chất
Gel “Bio-gel P-100”, hãng Bio-Rad có đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90µm; khả năng ngậm nước: 12ml/1g gel khô; phạm vi phân tách: 5000-100000 Daltons
Đệm phosphate 0,1M với pH=7 khử bọt trước khi dùng
Tiến hành
F Chuẩn bị gel
Cân 5g gel “Bio-gel P-100” khô, cho bột gel từ từ vào dd đệm phosphate 0,1M đựng trong cốc. 
Đối với các gel từ Bio-gel P-30 đến Bio-gel P-100 cần 12h ở 200C để hydrate hóa hoặc 4h nếu bắt đầu ở 1000C. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành không cần phải khuấy để ổn định trong suốt quá trình hydrate hóa.
Sau khi hydrate hóa hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dd vào bình hút chân không khử khí của dd từ 10-15’, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì có thể làm hư gel.
Thêm dd đệm khử khí với thể tchs gấp 2 lần thể tích lớp nền, và lắc nhẹ. Để ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phễu, đổ gel vào cột, đóng lổ thoát của cột và cho dd đệm làm đầy 20% thể tích cột
Rót đều dd gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ, tránh bắn gel đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel
Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn Flow Adaptor. Mở khóa đầu ra của cột rồi và cho dd đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh Flow Adaptor xuống lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng bơm hoặc tiêm mẫu qua Flow Adaptor.
F Chuẩn bị mẫu
Mẫu chạy sắc ký phải sạch ( không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dd đệm.
Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,4µm) sẽ làm gia tăng độ bền/ thời gian sử dụng của cột. Nếu vì tính chất của mẫu mà không lọc được thì đem ly tâm mẫu.
3.1.4. Thu và xác định mẫu được tách
Dịch ra khỏi cột được đo dộ hấp thụ ở 280nm bằng Detector trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc đồ bằng phần mềm LP Dataview trên máy tính.
Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (Collector), mỗi phân đoạn 2ml
IV. KẾT LUẬN
Sau đợt thực hiện làm tiểu luận công nghệ protein tôi đã tích lũy được thêm nhiều hiểu biết về những phần sau
Tìm hiểu và nắm được các quy trình tinh sạch một protein nào đó
Nắm được các nguyên tắc, phương pháp, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch protein.
Dù đã rất cố gắng nhưng do điều kiện về thời gian cũng như kiến thức còn hạn chế do đó không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ dẫn của thầy, cô. Em xin chân thành cảm ơn
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. giáo trình hóa sinh cơ sở PGS.TS. Trịnh Lê Hùng.
2. hóa sinh học GS.TSKH. Phạm Thị Trân Châu.
3. enzyme và ứng dụng GS.TSKH. Phạm Thị Trân Châu & PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa.
4. 
5. 
6. hóa sinh công nghiệp Lê Ngọc Tú.