Vai trò của vi sinh vật trong chuyển hóa đạm, lân

Lọ 2: chứa nước cất – dùng làm lọ đối chứng.
Để các mẫu phát triển trong 7 ngày dưới điều kiện ánh sáng bình thường ở nhiệt độ phịng .
Đo độ dài mầm lúa của lọ 1 với lọ đối chứngà Hạt nào cĩ độ dài hơn hạt của lọ chuẩn là cĩ chứa Gibberellinà Thu nhận chủng tạo Gibberellin.
Các chủng này sinh ra một phức hợp Gibberellin gồm nhiều chất được phân biệt bằng khoảng dịch chuyển (Rf) trên sắc ký và màu xuất hiện khi đi qua ánh sáng tử ngoại. Sử dụng phương pháp sắc ký với Gibberellin A3(acid Gibberellic), khi phun KMnO4 lên, nếu 2 vạch sắc ký bằng nhau thì kết luận dịch nuơi cấy là GA3.
b) Định lượng :
Phương pháp so màu của Muromsev.
Lấy 100ml dịch nuơi cấy + 10ml acetat (để yên 10-15 phút)à lọc bằng giấy lọcà dịch lọc + 1ml HNO3 đặc (pH=1-2) + 50ml ethylacetatà lắc 1-2 phút để phân lớpà thu dịch nổi cĩ ethylacetat và Gibberellinà so màu.
Dung dịch nổi phải hấp thụ vào đệm phosphat pH =5.2à lắc nhẹ 5 phút à để yên 10 phút à bỏ phần trên, thu dịch phần dưới. 
Dịch thu được cho vào ống nghiệm, mỗi ống 1ml + 0.5 dịch Foli (lắc)+ 2.5ml HClà để yên 15 phút à đem so màu ở bước sĩng 730nm.
Dựng đồ thị chuẩn với Gibberellin tinh khiết và chọn chủng cĩ khả năng cho Gibberellin cao.
Phương pháp sắc ký.
Dựa trên khả năng dịch chuyển của các chất Gibberellin trong hệ thống dung mơi hữu cơ khác nhau trên giấy, trên bản mỏng hay cột, các vết Gibberellin được gây hiện bằng bromphenol xanh. AgNO3, KMnO4, H2SO4 theo huỳnh quang trong tia cực tím. Để kiểm tra các vết Gibberellin, người ta cắt các vết này trên giấy rồi làm ướt hoặc hịa vào dung dịch, sau đĩ đặt các mảnh giấy cĩ vết hoặc dịch cĩ vết hịa tan vào gốc các cây non và tiến hành quan sát.
3.5. Lên men gibberellin.
Mơi trường lên men.
Hiện nay các chủng dùng trong cơng nghiệp lên men Gibberellin đều thuộc giống F.moniliforme. Do nhu cầu của ngành trồng trọt, ngành sản xuất thĩc malt và ngành trồng hoa, sản phẩm này ngày càng được sản xuất nhiều hơn và giá thành ngày càng giảm. 
Các nhà khoa học Nhật Bản đã đi đầu trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm này. Đầu tiên lên men Gibberellin bằng phương pháp nuơi cấy bề mặt, dùng glyceryl hoặc đường glucose làm nguồn cacbon và năng lượng, dùng amon clorua làm nguồn nitơ. Hiệu suất lên men theo phương pháp này rất thấp và những cơng trình này đến nay chỉ co ý nghĩa lịch sử để tham khảo.
Ngày nay lên men Gibberellin bằng phương pháp cấy chìm cho hiệu suất cao nhưng thời gian tương đối dài.
Các nguồn Carbon: Thường dùng trong lên men là glucose và saccharose với nồng độ từ 2.5%-4% cĩ khi lên đến 20% và hiệu suất lên men từ 100-200mg/l cĩ khi lên từ 500-600mg/l hoặc cao hơn. Ngồi ra, trong quá trình lên men cịn dùng các loại chất béo để phá bọt đồng thời cĩ thể dùng làm nguồn Carbon dinh dưỡng cho nấm. Bên cạnh đĩ, Glycerin, tinh bột, bột đậu tương cũng dùng trong lên men và dùng để nuơi cấy nhiều chủng cho hiệu suất Gibberellin cao.
Bột ngơ rất thích hợp làm nguồn Carbon trong sản xuất nhưng trước tiên bột này phải được thủy phân nhờ enzym.
Đặc biệt dùng dầu thực vật hoặc acid béo nuơi cấy một số chủng àcho hiệu suất lên men rất cao ( cao hơn cả khi dùng saccharose)
Nguồn Nitơ: Tối thích để sinh tổng hợp Gibberellin trên mơi trường đường là amon tartrat, chất này vừa là nguồn cung N vừa là nguồn cung C. 
Những muối amon của acid formic, acetic, propionic, lactic, oxalic, succinic, citric, clohyric và NaNO3 thường cho hiệu suất kém hơn. 
Các nguồn N hữu cơ dùng trong lên men Gibberellin là cao ngơ, bột đậu tương, bột mì và khơ hạt bơng. Dùng đậu tương 3% cho hiệu quả tốt, lúc này pH mơi trường đầu tiên cần phải ở vùng acid với PH ≈ 3.5
Theo kết quả của nhiều tác giả thì tỷ số C:N trong mơi trường lên men vào khoảng 60:70 cho hiệu suất lên men cao.
Mơi trường Rolen-Tom: là mơi trường lên men Gibberellin nổi tiếng. Thành phần(g/l) gồm:
Saccharose : 40-60
Tartrat amon : 7
KH2PO4 : 2 
MgSO4.7H2O: 0.2
K2SO4 : 0.2
Hỗn hợp các nguyên tố vi lượng.
pH = 5.5
Mơi trường này được bổ sung 0.5% cao ngơà làm tăng hiệu suất lên men.
Quá trình lên men.
Quá trình lên men điển hình ở Gibberellin gồm 2 pha, thời gian lên men dài ngày:
-Ở pha thứ nhất: sinh khối hệ sợi nấm tăng đồng thời với sự giảm các chất dinh dưỡng và tăng ít sản phẩm lên men
-Ở pha thứ 2: tích tụ Gibberellin, chủ yếu ở pha thứ hai. Hình A biểu diễn động học của quá trình lên men.
Theo Darken Jensen và Shu (1959) thì Gibberellin tạo thành sau thời kỳ sinh trưởng ngay của nấm, khi đĩ các chất dinh dưỡng cĩ trong mơi trường đã cạn.
Ở giờ lên men thứ 24, lượng hydratcarbon hầu như đã được nấm đồng hĩa gần hết để tăng sinh khối, pH mơi trường giảm rồi tăng lên, sau đĩ lại giảm và từ giờ thứ 96 giảm ít lại. Gibberellin được tích tụ vào cuối pha lên men đầu tiên và tăng dần đến cực đại ở ngày thứ 7, thứ 8. Thực chất trong quá trình lên men, Gibberellin được tạo thành nhiều ở giai đoạn nguồn Nitơ đã hết- ở pha thứ 2 khi hệ sợi ngừng phát triển. Tùy giống mà thời gian pha 1 thay đổi từ 2-3 ngày và Gibberellin được tạo nên trong pha này rất ít.
pH tăng nhanh cĩ thể liên quan đến việc sử dụng các acid hữu cơ được tạo thành trong mơi trường làm nguồn dinh dưỡng của nấm và hệ sợi bị tự phân.
Biện pháp nâng cao hiệu suất lên men.
Một trong những biện pháp nâng cao hiệu suất lên men là bổ sung hydrat Carbon vào mơi trường nuơi cấy làm nhiều lần, hoạt lực sinh tổng hợp của giống được tăng lên. Việc bổ sung thêm nguồn Carbon cũng gặp một số khĩ khăn cần giải quyết:
Dung dịch đường cĩ nồng độ đường cao à áp suất thẩm thấu cao à sẽ ức chế giống hoạt động và phát triển.
Nâng cao lượng đường ngay từ đầu sẽ cĩ ảnh hưởng xấu đến sinh tổng hợp Gibberellin.
Theo Borrow và những người cộng tác(1959) bổ sung đường mỗi ngày từ 1-2 lần và giữ nồng độ đường trong mơi trường ở mức thích hợp từ 1-4%. Phương pháp này cho phép thu được từ 800-1000mg/l Gibberellin sau 500-600giờ lên men. Tổng lượng đường glucose dùng cho lên men là 35%.
Muromsev và người cộng tác tiến hành lên men trên mơi trường 4% saccharose +3g/l NH4NO3, kết quả cho thấy: chủng F-6 tổng hợp được 150mg/l acid Gibberellin ( nếu khơng bổ sung thêm đường) và cĩ thể tổng hợp được 1000mg/l nếu nhiều lần bổ sung thêm đường (tổng lượng đường trong mơi trường lên tới 17%).
Muromsev nghiên cứu về nguồn Carbon dùng cho lên men (Saccharose và các loại dầu thực vật) và đã thu được nhiều kết quả cĩ ý nghĩa thực tiễn, hiệu suất lên men đạt được khoảng 1000-1700mg/l GA3.
Tổng hợp kết quả của các cơng trình nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy: Các chủng khác nhau của giống F.moniliforme cĩ sự khác nhau lớn về hoạt lực sinh tổng hợp Gibberellin từ vài chục mg đến g hoặc cao hơn trong 1lit dịch nuơi cấy). Trong mơi trường cĩ nồng độ đường vừa phải thì amon tartrat làm nguồn nitơ tốt nhất. Khi sử dụng bột đậu tương cũng cho hiệu suất tương đối cao nhưng pH ban đầu =3.5. 
Các chủng F.moniliforme cho hiệu suất cao trong quá trình lên men dài ngày, được bổ sung nguồn Carbon để giữ nồng độ này luơn trong khoảng 1-4% và tổng lượng đường tiêu hao cĩ thể >30%. Nguồn Carbon thích hợp cho lên men dài ngày là các dầu thực vật, mỡ cá voi, acid palmitic và acid oleic. Nồng độ chất béo tối thích là 8%. Trong trường hợp này nguồn Nitơ thích hợp là amon nitrat 0.3%. Dùng chất béo làm nguồn Carbon bổ sung vào mơi trường một lần hoặc nhiều lần đều cho hiệu suất cao hơn trong mơi trường đường. Gibberellin do nấm mốc tạo thành được tích lũy trong dịch nuơi cấy. Sau khi kết thúc lên men, dịch nuơi cấy được lọc để tách bỏ sinh khối hệ sợi và các tạp chất khơng tanà dịch lọc thu nhận được dùng để tinh chế Gibberellin.
3.6. Tinh chế gibberellin.
Cĩ 3 phương pháp tinh chế Gibberellin: phương pháp hấp thụ qua than hoạt tính hoặc nhựa trao đổi ion, phương pháp chiết suất bằng dung mơi và phương pháp kết tủa từ dung dịch.
Phương pháp hấp phụ qua than hoạt tính.
Phương pháp này được các nhà khoa học Nhật Bản dùng sớm nhất và cũng là phương pháp cổ nhất. Dung dịch Gibberellin đã lọc bỏ tạp chất khơng tan, được điều chỉnh pH=3-3.5 để cho Gibberellin hấp thụ ở than hoạt tính trong dạng phân tử. Sau đĩ dùng các dung mơi(aceton, cồn) để phản hấp phụ, dung mơi thích hợp nhất là aceton 70%. Đơi khi cịn dùng amoniac để kiềm hĩa dung mơi phản hấp thụ. Dịch phản hấp phụ chứa Gibberellin được lọc những tạp chất rắn rồi đem cơ đặc, sau đĩ chiết suất bằng dung dịch acetatetyl. Dịch chiết suất được đem cơ đặc à Gibberellin kết tinh.
Phương pháp hấp phụ trong khoảng vài chục năm gần đây được cải tiến bằng cách thay than hoạt tính bằng nhựa trao đổi ion để tách Gibberellin.
Phương pháp chiết suất bằng dung mơi.
Cĩ thể dùng các dung mơi như cồn, aceton, các este phức tạp để chiết suất Gibberellin từ dịch lọc sau khi lên men. Các dung mơi dùng trong cơng việc này tương đối thích hợp là metylizobutylceton, butanol và etylacetat.
Nhược điểm của phương pháp này là phải dùng nhiều dung mơi. Phương pháp kết tủa acid Gibberellic từ dung dịch bằng các ion Fe2+, Fe3+ trong mơi trường acid (pH=3-3.5). Các muối sắt thường dùng trong phương pháp này là FeCl2 và FeCl3. Kết quả thu được gồm phức hợp Gibberellin với sắt clorua và cĩ thể sử dụng trực tiếp trong trồng trọt hoặc dùng để tinh chế tiếp theo. 
Phương pháp kết tủa từ dung dịch.
Trong trường hợp dùng trực tiếp cho trồng trọt, người ta sấy khơ kết quả và nghiền nhỏ thu được chế phẩm ở dạng bột cĩ khoảng 19% Gibberellin. Chể phẩm này khi sử dụng được xử lý bằng nước amoniac 0.5%, loại bỏ phần khơng tan và thu được dịch muối amon của Gibberellin.
Trong trường hợp thứ hai, kết tủa ướt được hịa lỗng bằng nước amoniac, lọc bỏ phần chiết khơng tan. Dịch lọc là muối amon của Gibberellin được acid hĩa tới pH=2-2.2 rồi chiết Gibberellin bằng etylacetat, sau đĩ cơ đặc dịch chiết trong chân khơng cho đến khi Gibberellin kết tinh. 
3.7. Sản xuất Gibberellin dạng bột khơ
Gibberellin được cho qua máy sấy, đem phơi, hong hoặc sấy khơà chế phẩm được nghiền thành bột chứa 10% Gibberellinà kiểm tra chất lượng và xác định lại hàm lượng Gibberellin trong chế phẩm để điều chỉnh nồng độ chuẩn à đĩng gĩi.