Bài giảng Thực hành vi sinh ứng dụng

 nhận kết quả
Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là sự sinh khí, làm đục và giảm pH của môi trường
Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin
Độ pha loãng
Đục môi trường 
Sinh khí
pH môi trường 
NO3-
103
105
107
109
Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và ghi nhận hình thái học của các vi khuẩn phản nitrat hóa phân lập được.
Kiểm tra việc khử nitrat trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với diphenylamin:
Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO 4 đặc, sau đó thêm vào một giọt dịch nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu xanh thẫm. 
BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ
I. Lý thuyết
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm nguồn kiến tạo tế bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, nước gồm một số loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn quan năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat, nấm, tảo lam Ngoài ra khả năng cố định N còn có ở các vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu. Chúng có ý nghĩa quan trong trong việc chuyển N vô cơ thành N hữu cơ, đặc biệt là vai trò của vi khuẩn nốt sần, các loài trong giống Clostridium và Azotobacter.
II. Thực hành
Các loài Azotobacter thuộc loài vi sinh vật cố định nitrogen hoạt động nhất. Một số loài được nghiên cứu hơn cả là Az. Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, Az. Agilis và Az. Vinelandii trong ao hồ. Các loài này khác nhau về đặc điểm sinh trưởng trên môi trường đặc, kích thước, hình thái tế bào và một số đặc điểm sinh lý khác. Az. Chroococum tạo những khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc lan, lúc đầu không màu, sau chuyển thành màu nâu tối hoặc đen nhưng không lan màu sang môi trường. Az. Agilis và Az. Vinelandii thì có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng lục hoặc lam lục, và có sự khuếch tán vào môi trường. Khi còn non, tế bào Azotobacter hình que đầu tròn đứng riêng lẽ hoặc xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào chất nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ chu mao. Chiều dài tế bào thay đổi 2-3 đếm 4-6 μm, trong đó lớn nhất là tế bào của Az. Agilis. Dần dần, các tế bào hình que chuyển thành hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính 4 μm, hình dạng không cố định. Khi đó tiên mao rụng đi và tế bào trở nên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất hiện dạng hạt với nhiều chất dinh dưỡng mỡ, glycogen Ở tế bào Az. Chroococcum và Az. Vinelandii các tế bào tròn có thể phủ lớp vỏ nhầy và chuyển thành kén. Hình dạng tế bào và chu kỳ biến đổi của Azotobacter phụ thuộc tuổi của giống và điều kiện phát triển.
Tất cả các loài Azotobacter đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn cacbon khác nhau, monosacharit, disacharit, polysacharit (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất thơmNguồn nitrogen có thể là Nitrogen phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrit, aminoaxit. Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitrogen này trong môi trường mà quá trình cố định nitrogen phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít. Đồng thời Azotobacter có nhu cầu lớn đối với P và Ca. Azotobacter nhận được năng lượng từ quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2 và H2O.
Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng ở đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có thể phát triển trong môi trường với pH 3.
Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn.
Việc phát hiện Azotobacter được thực hiện trên môi trường chọn lọc Thompson-Sherman không chứa nitrogen hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ ẩm cao. 
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) tăng sinh 
	K2HPO4: 	1g
	MgSO4:	0,2g
	FeSO4:	0,2g
	CaCl2:	0,1g
	Na2MoO4:	0,001g
	Glucose:	10g
Nước máy:	1000ml
Thành phần môi trường Thompson-Sherman (N2-free glucose) phân lập 
	K2HPO4: 	1g
	MgSO4:	0,2g
	CaCl2:	0,1g
	Na2MoO4:	0,001g
	Glucose:	10g
Nước máy:	1000ml
	Agar: 	3% thể tích môi trường
Chuẩn bị môi trường Thompson-Sherman với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 121OC trong 15 phút 1 atm.
2. Tiến hành thí nghiệm
- Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50ml môi trường Thompson-Sherman tăng sinh đã hấp khử trùng với thành phần như trên. Ủ 4-7 ngày 30OC.
- Giai đoạn sau tăng sinh: Kiểm tra hình dạng, kích thước tế bào vi khuẩn có trong sinh khối đã tăng sinh dưới kính hiển vi quang học. Nếu có đúng hình thái khuẩn lạc, chuyển sang môi trường phân lập.
- Giai đoạn phân lập: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường Thompson-Sherman phân lập đã phân vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày, 30OC.
3. Quan sát ghi nhận kết quả
Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuẩn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.
Hình dạng tế bào
Bào tử
Kích thước
Sự sắp xếp tế bào 
Có roi 
Di động
Bao nhầy
Hình vẽ tế bào
Loại 1
Loại 2
Ghi nhận các loại khuẩn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả các khuẩn lạc đó
Khuẩn lạc loại
Hình dạng
Bề mặt
Độ trong
Màu sắc
Huỳnh quang
Khuếch tán màu vào môi trường 
Số lượng khuẩn lạc loại này
Loại 1
Loại 2
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản giọt ép đề quan sát bao nhầy. Soi kính hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường đứng thành đôi và có bao nhầy. 
Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng
Hình dạng tế bào
Bào tử
Kích thước
Sự sắp xếp tế bào 
Bao nhầy
Hình vẽ tế bào
Loại 1
Loại 2
BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
I. Lý thuyết
Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn Cacbon.
Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc acid, độ ẩm thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô cơ hóa cellulose đều thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulosase xúc tác việc phân giải cellulose thành cellobioase và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn, nấm...Trong đó, quan trọng nhất là niêm khuẩn.
Niêm khuẩn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10μm) hơi uốn cong, thường có đầu nhọn, thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuẩn khác. Trên cơ chất đặc niêm khuẩn có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuẩn có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành những tế bào dạng nghỉ, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau. 
Niêm khuẩn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài thuộc giống Cytophaga có tế bào đầu nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống Sporocytophaga có hình thái tương tự như Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những trực khuẩn đầu nhọn, có khả năng hình thành kén.
Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuẩn phát triển trong dạng thể nhầy, không có hình dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ tương ứng với chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít.
Ngoài niêm khuẩn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống Cellvibrio, tế bào uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuẩn lạc không màu hoặc có màu vàng lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không mạnh mẽ bằng niêm khuẩn.
Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus...
II. Thực hành
Hầu hết tất cả những loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí và ưa ẩm.
Việc phát hiện và xác định sô lượng các vi sinh vật phân giải cellulose trong điều kiện hiếu khí được tiến hành bằng cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên các đĩa chứa môi trường chọn lọc Hutchinson có nguồn cacbon duy nhất là xellulose. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí.
1. Môi trường và hóa chất
Môi trường Hutchinson (g)
	KNO3	2,5
	K2HPO4	1,0
	MgSO4	0,3
	CaCl2	0,1
	NaCl	0,1
	FeCl3	0,01
	Agar	3%
	Nước máy	1000ml
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị các đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần như trên, hấp khử trùng ở 1 atm.
Giấy lọc cắt thành những khoanh tròn kích thước tương ứng đĩa petri. Hấp khử trùng ở 1 atm.
Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù
Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 101 đến 1010, trang đều lên bề mặt bằng que cấy trang. Sau đó dùng kẹp sắt đã khử trùng trên ngọn lửa gấp 1 khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp sát lên bề mặt. Mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.
Đậy nắp đĩa petri đặt vào bình hút ẩm. Nuôi cấy 28-30OC trong 12-14 ngày đêm.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc trong mỗi đĩa petri.
Xác định xem khuẩn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuẩn, xạ khuẩn hay nấm khuẩn ty) chiếm ưu thế trên giấy lọc. Để phân biệt các khuẩn lạc nhỏ của xạ khuẩn và nấm, có thể quan sát trên kính hiển vi với vật kính 8X. Nhận xét sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được.
Khuẩn lạc loại
Hình dạng
Kích thước
Màu sắc
Mức độ phân giải cellulose
Số khuẩn lạc cùng loại ghi nhận được (khuẩn lạc/đĩa)
Loại 1
Loại 2
 Mô tả khác khuẩn lạc khác nhau của niêm khuẩn, ghi nhận các dấu hiệu. Chọn khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản cùng với các sợi cellulose từ những chỗ giấy lọc bị phân giải nhiều nhất. Lưu ý hình dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào tử nấm mốc
Khuẩn lạc loại
Tế bào sinh dưỡng
Vi kén
Hình vẽ tế bào 
Hình vẽ vi kén (nếu có)
Loại 1
Loại 2