Đề tài Xác định gene

ột là phải thiếu một chức năng sinh hóa nào đó mà ta có thể chọn lựa được hoặc bị vô hiệu hóa một số chức năng chuyên biệt 	Và có thể được bổ sung bằng một protein được sản xuất từ một thư viện biểu hiện cDNA. 	Sự bổ sung này đặc biệt hữu ích đối với các gene xác định của một sinh vật, nó bổ sung các khiếm khuyết trong các sinh vật khác.	Kỹ thuật xác định gene( dựa vào chức năng )	Ta có một ví dụ:	Hệ gen của nấm men có chứa gene mã hóa cho enzyme immidazole glycerol phosphate dehydrat. Đây là enzyme cần thiết cho sự tổng hợp amino aicd histidine mang tên là HIS3	Vi khuẩn E.coli lại chứa gene khiếm khuyết histidine mang tên là HIS B.	Ta biến nạp vào cơ thể E.coli một thư viện các tính trạng được biểu hiện ở nấm men, lúc này các gene HIS 3 ở nấm men và HIS B ở E.coli sẽ chia sẽ với nhau những trình tự DNA tương tự nhau, các protein được tổng hợp từ hai gen trên tuy trình tự amino acid của chúng khác nhau nhưng chúng thực hiện cùng một chức năng chung.Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Kỹ thuật Phage Display được thực hiện dựa trên sự kết hợp giữa virus và thực thể được biểu hiện như là các đoạn peptide, protein, đoạn kháng thể.	Sự kết hợp này cho phép thực hiện chọn lọc protein đặc trưng mong muốn từ một hỗn hợp chứa hàng triệu protein khác, sau đó có thể khuếch đại gen mã hóa protein này và xem đó như một phần của bộ gen của thực thể.	Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )Thư viện phage được dùng để chọn lọc ở đây là một đoạn kháng thể chuỗinặng ( sdAb ) Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng filamentous bacteriophage M13 Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )Cấu trúc của virion M13 có đường kính 65 Å và dài 9300 Å. Virion chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp bao gói trong 2700 	bản sao protein vỏ chính ( pVIII ). Mỗi đầu của phage được bao phủ bởi 2 protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản 	sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và pVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài bộ gene: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại.Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với F pilus của E. coli. Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn. Bên trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép (dsDNA) nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13. Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu. Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản. Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép. Sau đó virion lắp ráp và được đẩy ra khỏi vi khuẩn. Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Sàng lọc phage display dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau: 	1. khuếch đại thư viện và tạo phage. 	2. cho phage tiếp xúc với đích. 	3. loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa. 	4. tách phage gắn.	5. tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên.	Sau đó chu trình được lặp lạiKỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Sàng lọc thư viện phage display	Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thư viện có độ đa dạng càng cao càng tốt. Thông thường, thư viện phage được giữ dưới dạng phagemid ( một đạng kết hợp giữa M13 và plasmid của E.coli) nằm trong tế bào chủ là E. coli. Do đó, bước khuếch đại này thực chất là khuếch đại tế bào E.coli.	Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid. 	Bước lắp ghép này cùng với việc sử dụng enzyme giới hạn hiếm SfiI, cho phép tách dòng theo một chiều duy nhất. Sau đó biến nạp vào thư viện phagemid chứa kháng thể vào E. coli.Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Cho phage tiếp xúc với đích		Sau khi khuếch đại thư viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên được biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với đích. Để làm được điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phương pháp cố định kháng nguyên đã được phát triển cho kỹ thuật phage display. Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua. Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Rửa và tách		Mục tiêu chính của bước rửa là loại bỏ phage không gắn trong quá trình chọn lọc. Tuy nhiên, phải thiết kế cẩn thận bước này vì cần sự cân bằng giữa tính đặc hiệu và ái lực của dòng phage được chọn. Trong thực nghiệm, cân bằng này đạt được bằng cách điều chỉnh thời gian rửa, nồng độ chất tẩy và sử dụng chiến lược tăng dần độ khắc nghiệt. Tăng hoặc giảm đột ngột pH là phương pháp thường được sử dụng, hoặc có thể dùng các chất khử để phá vỡ liên kết disulphide giữa giá thể và đích. Một cách tinh vi hơn là dùng enzyme khi tính toàn vẹn của phage bị ảnh hưởng bởi các điều kiện tách khắc nghiệt.Kỹ thuật xác định gene( kỹ thuật phage display )	Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ		Thông thường, sau khi tách phage gắn, luôn cần khuếch đại quần thể phage thu được trước khi tiến hành các vòng sàng lọc tiếp theo. 	Tuy nhiên, một số báo cáo chỉ ra rằng sử dụng trực tiếp phage sau khi tách mà không khuếch đại có thể giúp giảm số phage gắn không đặc hiệu chắc chắn tồn tại trong quá trình sàng lọc. Ứng dụng kỹ thuật xác định gene	Dưới đây là một thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30).1. Nguyên liệu ban đầu	Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis	Plasmid pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmid pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.	Thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plasmid pGAD424 mang gen Leu	2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu:	Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2,R2 và F3.	Các hoá chất tinh khiết dùng cho sinh học phân tử	Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit, 	dNTP-0.25 microMol, 	đệm tris có pH:8.0-10 mM, 	MgCl2-1mM, DNA mồi (primer),-50ng, 	 DNA khuôn (template) 10-20ng) ,	94oC:45s 55 oC:45s,	72oC :45s. 	Số chu kỳ lặp lại : 35.	Các kỹ thuật sử dụng	 	Sử dụng các kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli 	Biến nạp vào nấm men 	Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị 	1.     Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR.	Gen TTP30 của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 acid amin TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn.	Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2.		2.     Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI. 	Tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI . Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha).	Nuôi cấy E.coli chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmid và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.	Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp. 	Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình dưới	3.     Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30.	Tiến hành tách plasmid pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên. 	Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc: 	MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp), 	MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30) 	Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để khẳng định các thể biến nạp thu được đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính. Đồng thời dùng phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit pGAD424.Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu đượcNHẬN XÉT:Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng. Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo