Giáo trình Vi sinh vật học - Phần 2

 menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12.
Phân tích thành phần đường trong tế bào
1.     30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC trong 2 giờ.
2.     Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch Ba(OH)4 bão hòa.
3.     Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, chuyển dịch trên sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không
4.     Hòa tan bằng 300 μl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu.
5.     Chạy sắc ký bản mỏng TLC: 
-         TLC cellulose
-         3 μl mẫu
-         1 μl chuẩn
Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
Chuẩn 3: madurose (3-O-methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
-     Dung môi chạy TLC: n-buthanol:water:pyridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v)
-         Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 ml dung dịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100oC trong 4 phút  
-         Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp dưới
Chuẩn 1:          Glucose: vàng
                            Mannose: vàng
                            Ribose: đỏ
                            Rhamnose: vàng
      Chuẩn 2:        Galactose: vàng
                            Arabinose: đỏArabinose: đỏ
                            Xylose: đỏ
      Chuẩn 3:         Madurose: vàng
6.     Điều kiện chạy HPLC:
-         Cột: cột trao đổi anion 
-         Dung dịch A: Acid boric 0.1 M 
+ Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW 
+ Thêm KOH 4M đến pH 8
-         Dung dịch B: Acid boric 0.4M 
-         + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW
+ Thêm KOH 4M đến pH 9
-         Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min
-         Nhiệt độ: 65oC
-         Phản ứng nhận biết:
Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW
Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min
Nhiệt độ: 150oC
Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm
          Chương trình
Thời gian (phút)    Nồng độ Sol B
         0                          0                 Dung dịch C: 0.2ml/min
         50                         100                                                                      57                        100                                                                      57.1                      0                                                                         65                         dừng
Phân tích thành phần acid béo
1.     5mg  tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex  5- 10 sec, giữ ở 100oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC
2.     Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80oC trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng
3.     Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước)
4.     Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu)
5.     Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa.
Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80oC.
R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml
R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5
R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml
R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml
R5: 100ml MQ + 40g NaCl
6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI)
Phân tích thành phần phospholipid
1.     100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút.
2.     Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa.
3.     Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20oC.
4.     Hòa tan bằng 100 μl ethanol.
5.     Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance)
6.     Dung môi chạy TLC chiều 1:
Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4
Dung môi chạy TLC chiều 2:
Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard
Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5
7.     Nhận biết các loại phospholipid:
Bản 1: Nhận biết các glycolipit:
Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde:
     Acetic acid           1ml
     p-anisaldehyde      5ml
     H2SO4                            5ml
     Ethanol                 90ml
Phun thuốc thử, giữ ở 110oC trong 15 phút
Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh. 
Bản 2: Nhận biết các amino lipit
-         Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120oC trong vài phút.
-         Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG
Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester
-   Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester:
Sol I       25N H2SO4 100mg
              MoO3                   4,011g
              Hòa tan bằng cách đun ở 90oC đến khi dung dịch trở nên trong
SolII       Iot               50mg
              Mo              0,178g
              Đun trong 15 phút, để nguội, lọc
Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh
-         Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên
Bản 3: Nhận biết các choline lipit
-         Thuốc thử Dragendorff:
Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH)2NO3]       1,7g
          Acetic acid                                            20ml
          Water                                          80ml
Sol B: KI                                                        10g
          Nước                                           25ml
Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước.
-         PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam
Bản 4: 
-         Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid.
-         Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này cho thí nghiệm tiếp theo.
Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH
-         Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic
-         Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa
-         Phun nước (loại muối periodate)
-         Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng nhận biết bằng Iot biến mất.
-         Phun thuốc thử Schiff
-         PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa đường hiện lên màu xanh
Phân tích thành phần G+C trong ADN
1.     25μl ADN (2-25μg), giữ ở 60oC trong 1 giờ. Giữ ở 100oC trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down.
2.     Mẫu ADN 25μl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO4 25μl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25μl. Spin down. Giữ ở 37oC trong 1 giờ.
3.     Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 μl + alkaline phosphatase 2μl (0.35U/μl). Spin down. Giữ ở 37oC trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC
4.     Điều kiện HPLC:
-         Cột Cosmosil5 C18
-         Nhiệt độ 35oC
-         Dung môi: 0,2M ammonium phosphat: acetonenitril (40:1)
-         Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min
-         Bước sóng: 275nm
Phương pháp tách ADN xạ khuẩn
-         Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28oC
-         Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4oC, thu sinh khối
-         Rửa bằng TE
-         Nghiền mẫu
-         Thêm 500 μl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều
-         Thêm 50 μl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37oC trong 1 giờ
-         Thêm 50 μl SDS 20%, 50 μl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55oC trong 30 phút
-         Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần.
-         Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều
-         Thu ADN bằng đũa thủy tinh
-         Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên
-         Thêm 500 μl TE
Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau:
-         Thêm 50 μl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 μl RNase T1, giữ ở 37oC trong 20 phút
-         Thêm 50 μl proteinase K, giữ ở 37oC trong 1 giờ
-         Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần.
-         Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều
-         Thu ADN bằng đũa thủy tinh
-         Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên
-         Thêm 100-200 μl TE
 Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes. 
Tài liệu tham khảo:
1.     Miyadoh S. (ed.). 1997. Atlas of actinomycetes. Asakura Publishing Co. Ltd, Japan.
2.     Miyadoh S. (ed.). 2001. Identification manual of actinomycetes. Business Center for Academic Societies Japan.
3.     Williams S. T.,M.E. Sharpe , J.G. Holt (ed.). 1989. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, USA.
Holt J.G, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams.2000. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (9th edition). Lippincott Williams & Wilkins