Giáo trình Vi sinh vật học - Phần 8

ol primer, 2 ml đệm phản ứng và bổ sung nước cho đủ 15 ml.
Phản ứng tốt sẽ đọc được trình tự dài khoảng 400 bps.
Cách tiến hành cụ thể:
1.     Biến tính ADN (theo hai cách trình bày ở trên).
A.   Biến tính với glycerol:
ADN:                               0.5 – 0.3 mg (thể tích tối đa 7 ml).
Đệm biến tính plasmid:    5 ml.
Primer:                             1 ml.
Nước cất dẫn đến:            13 ml.                 
Trộn đều, ủ trong 5 phút ở 90 – 100 oC, làm lạnh nhanh trên đá.
Bổ sung thêm đệm phản ứng: 2 ml để đạt được tổng thể tích là 15 ml.
                        B. Biến tính với kiềm (không cần kết tủa với ethanol).
     Thành phần phản ứng gồm:
         ADN:                    0.5 - 3mg  (thể tích tối đa là 8ml)
         NaOH 1M:            2 ml.
         Primer:                  1 ml.
         Nước cất dẫn đến: 11 ml. 
              Trộn đều, giữ trong 10 phút tại 37oC, làm lạnh nhanh trên đá.
Điều quan trọng trong phương pháp này là bước trung hòa phải được thực hiện chính xác với HCL.
              Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml.
              Đệm phản ứng plasmid:     2 ml.
              Tổng thể tích là:                15 ml.
2.     Bắt cặp mồi vào sợi khuôn:
Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37oC trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh (mẫu chỉ nên dùng trong vòng 4 giờ).
3.     Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi:
Trong khi thực hiện bước bắt cặp sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút 2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để dùng cho các bước 5 và 7.
         4. Pha loãng dịch đánh dấu:
Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với nước và giữ trên đá. Không nên pha loãng dịch đánh dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi.
                  Dịch đánh dấu: 2 ml
                  Nước:               8 ml
                  Tổng số:           10 ml.
5. Làm ấm các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3: 
Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3 lần lượt là ACGT được ủ ở 37oC trong 1 phút.
6. Phản ứng đánh dấu (kể từ bước này thì mọi đầu côn và pipét sẽ thực hiện với hóa chất phóng xạ, do đó cần phải có các biện pháp bảo vệ và đeo găng tay).
Bổ sung lần lượt các thành phần sau vào 15 ml hỗn dịch bắt cặp đã được chuẩn bị trong bước 1.
         DTT 0.1M :                                         1 ml
         Dịch đánh dấu (bước 4):                     2 ml
         Hóa chất phóng xạ: S35 (P33, P32):       0.5 ml
         Enzym T7 sequenase cho plasmid:      2 ml
         Tổng thể tích :                                  20.5 ml
    (Thể tích này sẽ được chia ra 4 phần trong bước 7)
Trộn đều (tránh bọt), ủ hỗn dịch tại nhiệt độ phòng 2 -5 phút (đối với plasmid làm biến tính trong glycerol thì ủ 5-10 phút tại nhiệt độ phòng hoặc 5 phút tại 37oC). Thường bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid cuối cùng, sau khi các thành phần khác đã được bổ sung. Không bao giờ bổ sung hỗn dịch T7 sequenase cho plasmid vào hỗn dịch đánh dấu, DTT hay hỗn dịch khác không phải là đệm.
Chú ý: Nếu trong trường hợp chất phóng xạ S35 để quá lâu thì có thể tăng lượng lên 2 ml cho mỗi phản ứng, sau đó giảm lượng nước tương ứng.
7. Phản ứng kết thúc chuỗi:
a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết thúc chuỗi đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và li tâm nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút tại 37oC (có thể kéo dài tới 30 phút). Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước khi tiến hành phản ứng đánh dấu.
b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào thành trên của các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản ứng tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng.
c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng, sau bước này phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ ở 4 oC để sử dụng trong ngày hôm sau.
d. Xử lý ở nhiệt độ 75oC cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng.
e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa một lượng đồng mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ.
Hóa chất:
Hỗn dịch kết thúc chuỗi:
Tube
A
C
G
T
dATP
80μM
80μM
80μM
80μM
dCTP
80μM
80μM
80μM
80μM
7-deaseGTP
80μM
80μM
80μM
80μM
dTTP
80μM
80μM
80μM
80μM
ddATP
8μM
ddCTP
8μM
ddGTP
8μM
ddTTP
8μM
NaCl
50 mM
50 mM
50 mM
50 mM
            Dịch dừng phản ứng:
                   95% Formamide 
                   20mM EDTA (Na2), pH 8.0
                   0.05% Bromopheno Blue (BPB).
                   0.5% Xylen CyanolFF (XC).
         Chú ý, nếu bạn gặp trục trặc với việc giải trình tự ADN thì các plasmid nên được tái tinh sạch với Genee-Clean hoặc sắc ký trao đổi ion.
Hình 1.11. Tra mẫu trên thiết bị chạy gel.
Các phần dưới đây đề cập đến một số vấn đề nảy sinh và cách giải quyết khi tiến hành giải trình tự ADN.
- Muốn đọc được trình tự ADN dài hơn:
Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được đoạn gene đến mức có thể trên gel. Thông thường thì kích thước đọc cho mỗi phản ứng trên gel là 250-300 nucleotid. Với thời gian chạy gel lâu khoảng 8 giờ thì có thể đọc được kích thước gene dài hơn 400 nucleotid. Nếu sử dụng gel gradient sẽ không phù hợp cho mục đích này vì khoảng cách giữa các băng ADN sẽ hẹp tới mức không thể đọc được. Nồng độ gel acrylamid dao động 4-6% là thích hợp cho kết quả tốt. Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với gradient muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước 16).
- Sự dồn các băng:
Nguyên nhân chung để không thể hoàn tất việc giải trình tự ADN là các băng không rõ do cấu trúc bậc hai trong sản phẩm của phản ứng kéo dài chuỗi, điều này thường được mô tả là sự dồn ép các băng do các băng bị thu hẹp một cách bất thường trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN. Các khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên kết G-C bổ sung kèm với 2-5 base có thể dẫn đến kết quả không thể đọc được đoạn gene chiếm một khoảng nhỏ trên bản gel. Khoảng trống bất thường là do ảnh hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc bậc 2 sẽ có cùng tốc độ di chuyển như là sợi thẳng có chiều dài ngắn, tại ví trí bản fim ngoài vùng dồn băng thì khoảng cách các băng sẽ rộng khác thường do sự kém bền của cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi trở nên như bình thường.
Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén có thể được khắc phục bằng cách thực hiện việc đọc trình tự trên cả hai sợi. Sự bất thường về việc di chuyển nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp. Điều này có nghĩa vùng gene có các băng không rõ ràng sẽ được khắc phục bằng cách sử dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải trình tự ADN. Lý do là base I chỉ có 2 liên kết với C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết quả là ADN sẽ dễ duỗi hơn. Kỹ thuật này thường được dùng, do đó dITP có trong KIT sequenase.
Một cách khác có thể làm kém bền vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là thực hiện chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide trong nước dùng đổ gel). Trong trường hợp này khi thay thế 25% formamide cho nước sẽ đạt được kết quả tốt nhất. Gel có formamide thường được dùng khi vùng dồn nén khá gần mồi, nên xử lý formamide qua gel trao đổi ion ngay trước khi chuẩn bị gel.
Trong các trường hợp mà các cấu trúc cặp đôi phức tạp hơn khi mà vùng dồn nén lại nằm ngay tại vị trí tương đồng trên sợi đối diện. Khi đó cách giải quyết sẽ trở nên khó khăn vì với các kỹ thuật hiện có thường đưa lại các kết quả khác nhau.
- Cường độ các băng thiếu sự đồng nhất:
Một vấn đề khác trong phản ứng giải trình tự ADN là cường độ các băng không đồng nhất. Điều này thường xuất hiện trong phương pháp giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương pháp phát hiện bức xạ huỳnh quang. Sự thiếu đồng nhất là do sự có mặt của sequenase cần Mg++ gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác nhau tại các vị trí khác nhau (vấn đề này được bàn luận kỹ trong tài liệu USB sequenase).
b.      Kỹ thuật giải trình tự ADN trên thiết bị giải trình tự ADN tự động:
Hình 1.12. Thiết bị giải trình tự ADN tự độngg
(3100-Avant Genetic Analyzer)
            Trong phần này chúng tôi đề cập phản ứng giải trình tự ADN trên 2 loại thiết bị chủ yếu hiện đang được dùng phổ biến là: Beckman Coulter và ABI 3100-Avant
         Chuẩn bị mẫu giải trình tự ADN:
1.     Thành phần phản ứng (cho 1 phản ứng 20 ml):
- Terminator Ready Reaction Mix*: 8 μl
- Template:                                        80-100 ng
              ( với plasmid là:                  300ng)
- Primer :                                           3.2 pmol
- Nước cất vô trình:                      đủ 20 μl
Chuẩn bị Teminator Ready Reaction Mix cho 4 phản ứng:
15 μl Bigdye Sequencing Buffer 3.1 (5X) + 15 μl nước = 30 µl (2.5X)
20 μl đệm 2.5X + 20 μl Ready Reaction Premix= 40 μl Terminator Ready Reaction Mix (dùng 8 μl) cho một phản ứng.
2. Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được thực hiện trong 200 ml tube hay trong microplate.
Cycling được thực hiện trong máy PCR theo chương trình sau:
         Denature 96oC:    1 phút
96 oC:                  10 giây
50oC:                   5 giây
60oC:                   4 phút
Cycling:              25 cycles.
            3. Kết tủa sản phẩm PCR:
         - Cho vào 5µl EDTA 125 mM  + 60µl E-OH 100%E-OH 100%
         - Trộn đều, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 000 v/phút
         - Rửa lại bằng 60µl E-OH 70% và lại ly tâm (4oC)
         - Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng (Speed Vac).
- Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di formamide, trộn đều sau đó ủ ở 96oC trong 2 phút.
         - Để trên đá trước khi cho vào seq.
         4. Đưa mẫu vào máy đọc trình tự.
 Phòng thí nghiệm "ảo" :  
Formazan gồm MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-dihphenyl-2H-tetrazolium bromide) và nước hòa tan XTT (23-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide).