Giáo trình Di truyền y học - Chương 12: Lập bản đồ gene

ần mềm này còn ghi nhận các mẫu gene điển hình 
mã cho các loại protein đặc hiệu 
 v.v... 
Cơ sở dữ liệu (database) về những đoạn DNA đã biết được vi tính 
hóa đóng mộ
oạn nào đó của DNA để tìm một gene, ngươi ta sẽ tìm sự tương đồng 
giữa đoạn DNA của vùng này với các thông tin đã được lưu trữ về trình tự 
của DNA đã biết trong cơ sở dữ liệu của máy. Các thông tin này được lấy 
từ các gene đã biết chức năng hoặc từ các mRNA được tổng hợp tại các 
mô đặc hiệu. 
Giả sử chúng ta đã sử dụng việc phân tích liên kết để xác định một 
vùng chứa m
 hạn. Khi thực hiện kỹ thuật "đi dọc NST" chúng ta sẽ tìm kiếm sự 
tương đồng giữa 1 đoạn DNA lấy từ vùng này với một đoạn DNA có trong 
cơ sở dữ liệu như trình tự DNA của một gene mã cho một protein liên 
 18 
 quan đến sự phát triển của xương như một yếu tố phát triển nguyên bào 
sợi (fibroblast growth factor). Vì các gene mã hóa cho các sản phẩm 
protein tương tự thường có trình tự DNA tương tự. Sự tương đồng trong 
trình tự DNA giữa đoạn DNA lấy từ vùng này với một đoạn trong cơ sở 
dữ liệu gợi ý đoạn DNA này thực sự là một phần của gene gây dị dạng chi. 
Các cơ sở dữ liệu được dùng trong việc tìm kiếm các đoạn tương 
đồng thường là trình tự của các đoạn DNA nhỏ đã được gọi là expressed 
seque
ả ở phần trước như lập 
bản đ
nh tự của 
một s
ác gene này và các sản 
phẩm
nce tags (ESTs). ESTs thu được từ việc đọc trình tự của hàng trăm 
bp từ hai đầu của các dòng cDNA lấy từ thư viện cDNA. Vì các clone này 
chỉ gồm các DNA bổ sung chính xác với mRNA nên ESTs đại diện cho 
các phần biểu hiện (expressed) của gene. Thường chúng chỉ biểu hiện ở 
một số mô nhất định ở những thời điểm nhất định. 
Các EST có thể được lập bản đồ trên các NST đặc hiệu bằng cách sử 
dụng các kỹ thuật lập bản đồ vật lý đã được mô t
ồ gene bằng kỹ thuật lai phóng xạ (radiation hybrid mapping) hoặc 
kỹ thuật FISH. Khi đó các nhà nghiên cứu có thể tìm kiếm trình tự tương 
đồng giữa các đoạn DNA tại một vùng đang được quan tâm với các ESTs 
đã biết. Nếu có sự tương đồng, vị trí của đoạn DNA trên NST sẽ ở cùng 
một vùng với ESTs đó và qua đó cũng có thể biết loại mô liên quan tới 
loại bệnh đang khảo sát (nơi gene đó hoạt động sao giải mã). Việc xác 
định các ESTs đã và đang được thực hiện một cách nhanh chóng và hiện 
đã có gần 2 triệu ESTs trong các dữ liệu trên máy. Kỹ thuật này đã được 
sử dụng để xác định một trong số các gene gây bệnh Alzheimer. 
Việc tìm kiếm sự tương đồng về trình tự không nhất thiết đòi hỏi 
phải sử dụng gene người. Người ta thấy có sự tương ứng giữa trì
ố gene đã biết chức năng ở người với các gene của chuột nhắt hoặc 
thâm chí của nấm men hoặc vi khuẩn . Vì các gene mã hóa cho các sản 
phẩm protein quan trọng có xu hướng được bảo tồn trong quá trình tiến 
hóa nên sự xác định sự tương đồng giữa gene người với gene của một sinh 
vật khác có thể cung cấp những thông tin quan trọng về chức năng của 
gene đó ở người. Ví dụ nhiều gene liên quan đến việc đìều hòa chu kỳ sinh 
sản tế bào hoàn toàn tương tự giữa người và nấm men như giữa các đoạn 
của gene NF1 người với gene IRA2 của nấm men. 
Có khoảng một phần ba số gene gây bệnh ở người đã được xác định 
là có sự tương đồng với các gene ở nấm men. C
 của nó có thể được thí nghiệm một cách dễ dàng trên các sinh vật thí 
nghiệm. Qua những hiểu biết về chức năng của chúng trên các sinh vật thí 
nghiệm sẽ giúp hiểu biến tốt hơn về chức năng của chúng trên người. Một 
số các gene bệnh quan trọng ở người đã được xác đinh bởi vì có các gene 
 19 
 gây ra biểu hiện tương ứng đã được xác định trước đó ở các sinh vật khác. 
Ví dụ sự tương ứng giữa gene gây bệnh mắt nhỏ ở chuột và gên gây tật 
không có mống mắt (aniridia) ở người. 
8. Sàng lọc các đột biến trên trình tự DNA 
Ngay khi một phần của DNA mang mã
được đánh giá các đột biến bằng cách sử
 đã được phân lập, nó có thể 
 dụng các kỹ thuật như SSCP 
(singl
 của bệnh 
nhân 
y là những mất đoạn quá 
nhỏ d
 cải 
tiến b
e - strand conformation polymorphism), DGGE (denature gradient 
gel electrophoresis) và đọc trình tự DNA trực tiếp (direct DNA sequence) 
v.v.... Nếu một đoạn DNA đại diện cho gene bệnh thì nó chỉ thấy ở các cá 
thể mang bệnh chứ không thể thấy ở những người bình thường. 
Để giúp phân biệt các đột biến gây bệnh với các tính đa hình vốn có 
mặt một cách bình thường ở mọi cá thể, người ta so sánh DNA
mắc bệnh do một đột biến mới gây ra với DNA của bố mẹ không 
mắc bệnh. Trong khi tính đa hình không có hại sẽ được thấy ở cả bố mẹ 
không mắc bệnh và cả con cái mắc bệnh, một đột biến mới gây bệnh sẽ chỉ 
thấy ở con mà không thấy ở bố mẹ. Đây là phương cách hữu ích trong việc 
xác định các đột biến gây ra các bệnh di truyền trội NST thuờng có tính 
thấm cao như bệnh u xơ thần kinh type 1 (NF1). 
Một loại đột biến khác có thể được đánh giá là các trường hợp mất 
đoạn dưới hiển vi (submicroscopic deletion), đâ
o đó không thể quan sát bằng kính hiển vi được. Các mất đoạn này 
chỉ có thể được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật Southern Blot. Một 
mất đoạn như vậy sẽ làm hình thành một đoạn giới hạn (restriction 
fragment) nhỏ hơn bình thường làm nó di chuyển nhanh hơn trên gel. 
Đôi khi các mất đoạn lớn hơn có thể được phát hiện thông qua kỹ 
thuật điện di trên gel giống như trong kỹ thuật Southern Blot nhưng
ằng việc cắt giới hạn (restriction digest) được thực hiện bằng các 
enzyme cắt ở vị trí giới hạn (recognition site) hiếm gặp do đó số lần DNA 
bị cắt sẽ ít đi, do vậy sẽ làm xuất hiện các đoạn giới hạn có chiều dài từ 
vài chục đến vài trăm kb. Những đoạn này do có kích thước quá lớn nên 
khó phân biệt với nhau khi thực hiện điện di trên gel theo cách thông 
thuờng nhưng bằng cách thay đổi chiều của xung điện ngang qua gel 
(xung sau được thực hiện ở góc 900 so với xung trước), các đoạn này sẽ di 
chuyển một cách khác nhau phụ thuộc vào kích thước của chúng và cho 
phép phân biệt chúng dễ dàng hơn. Vì vậy phương pháp điện di này được 
gọi là phương pháp điện di trường xung điện ( pulsed field gel 
electrophoresis). 
 20 
 9. Test phát hiện sự hoạt động sao mã của gene 
Để kiểm tra xem một gene có phải nó chịu trách nhiệm cho một 
bệnh nào đó không, người ta có thể kiểm tra ở các mô khác nhau để xác 
định xem gene đó hoạt động sao mã ở mô nào. Việc kiểm tra được thực 
hiện bằng cách tinh khiết mRNA chiết từ một loại mô nào đó, đặt nó trên 
miếng thấm (blot) và cho lai với một probe làm từ gene này để phát hiện. 
Kỹ thuật này được gọi là Northern blotting (ý muốn nói tương tự như kỹ 
thuật Southern blotting nhưng thay vì các đoạn DNA thì ở đây là mRNA) 
(hình 14). Nếu gene này chính là nguyên nhân gây bệnh thì phân tử 
mRNA của nó sẽ có mặt ở các mô là chịu ảnh hưởng của bệnh (nguyên lý 
của phương pháp này cũng giống như nguyên lý của việc phân tích bằng 
ESTs ). 
Ví dụ enzyme phenylalanine hydroxylase được tổng hơp ở gan do 
đó gene mã cho phenylalanine hydroxylase (đột biến sẽ gây bệnh phenyl-
ketonuria, PKU) sẽ hoạt động sao mã ở tổ chức này. 
Hình 14: Một ví dụ về kỹ thuật Northern Blot. Trên ảnh cho thấy hiện tượng lai 
giữa một probe cDNA từ gene EVI2A (một gene cài vào trong một đoạn intron 
của gene NF1) với mRNA được lấy từ tuyến thượng thận, não, và các nguyên 
bào sợi. Kết quả cho thấy EVI2A được biểu hiện ở não ở mức độ cao hơn ở hai 
loại mô kia. 
Một test khác cho phép đánh giá trực tiếp sự biểu hiện của gene là 
đưa một đoạn DNA bình thường vào trong một tế bào bị khiếm khuyết lấy 
ra từ một cá thể mắc bệnh (hoặc từ các mô hình bệnh tương tự ở sinh vật 
 21 
 thí nghiệm) bằng kỹ thuật DNA tái kết hợp. Nếu đoạn DNA bình thường 
này khắc phục được khiếm khuyết của tế bào có nghĩa là nó có thể đại 
diện cho gene bệnh mà chúng ta quan tâm. Kỹ thuật này đã được dùng để 
chứng minh các đột biến trên gene CFTR có thể gây bệnh xơ nang (cystic 
fibrois). 
Tuy nhiên việc dòng hóa các gene đôi khi rất phức tạp và khó khăn 
do nhiều yếu tố khác nhau, chẳng hạn như việc phân lập các đoạn DNA 
gối đầu (overlapping) có thể trở nên rất khó khăn khi gặp phải các đoạn 
lặp dài trên DNA . Những khó khăn này làm cho việc dòng hóa các gene 
trở thành một công việc tiêu tốn nhiều thời gian và công sức. 
Mặc dầu gene gây bệnh Huntington được xác định là nằm trên 
nhánh ngắn của NST số 4 từ năm 1983 nhưng phải mất 10 năm làm việc 
vất vả của một nhóm gồm nhiều nhà nghiên cứu gene này mới được dòng 
hóa. Việc dòng hóa gene gây bệnh xơ nang (cystic fibrosis) cũng mất 4 
năm. 
Việc dòng hóa các gene hiện đã được tiến hành với nhiều thuận lợi 
hơn nhờ các kỹ thuật dòng hóa tốt hơn và các vector mới được phát minh 
(như BACs, PACs và YACs có khả năng cài các đoạn DNA lớn hơn nhiều 
so với các cosmid). Việc sử dụng các mốc vật lý dùng để lập bản đồ gene 
(STSs) cũng làm tăng tốc độ và hiệu quả của việc dòng hóa gene. 
10. Các gene ứng viên (candidate genes) 
Việc săn tìm gene được tiến hành hiệu quả hơn nhiều khi đã có sẵn 
một gene úng viên. Như tên gọi đây là một gene mà sản phẩm protein của 
nó làm nó trở thành một ứng viên cho một bệnh đang cần tìm nguyên 
nhân. Ví dụ như các gene mã cho các loại collagen khác nhau được xem là 
các ứng viên có thể là nguyên nhân của hội chứng Marfan vì collagen là 
một thành phần quan trọng của tổ chức liên kết. Tuy nhiên việc phân tích 
liên kết bằng cách sử dụng các marker của gene collagen trên các gia đình 
mắc hội chứng này đã không đem lại kết quả. 
Khi gene fibrilline - 1 được xác định trên NST 15, nó đã trở thành 
một gene ứng viên cho hội chứng này (fibrilline cũng là một thành phần 
của mô liên kết). Việc phân tích liên kết cũng đã định vị được gene gây 
hội chứng Marfan trên NST 15 vì vậy gene fibrilline - 1 trở thành một ứng 
viên có nhiều khả năng đã gây ra hội chứng đó. 
 Việc phân tích các đột biến trên gene fibrilline - 1 đã chứng tỏ 
những đột biến này kết hợp một cách hằng định với hội chứng Marfan và 
cho phép khẳng định những đột biến này là nguyên nhân gây bệnh. 
 22